李 龍 李 莉 崔天祥 趙 狄 (鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南 鄭州 450000)

Kuro-o等〔1〕在1997年研究自發(fā)性高血壓大鼠時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與人類衰老相關(guān)的基因——klotho基因，以后確認(rèn)klotho基因缺失鼠(kl-/-)的表型類似人類的衰老表現(xiàn)，包括血壓升高、壽命縮短、動脈硬化、內(nèi)皮功能障礙、肌肉萎縮、認(rèn)知障礙、骨質(zhì)疏松等。研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增加，klotho基因的表達(dá)量逐漸降低，高血壓患病率逐漸升高〔2〕，二者之間可能存在相關(guān)。Rhee等〔3〕發(fā)現(xiàn)klotho基因啟動子G395A多態(tài)性影響klotho蛋白表達(dá)。血漿klotho蛋白水平降低易導(dǎo)致高血壓早期腎損害及高血壓腦損害，但klotoh基因與高血壓左室肥厚的關(guān)系尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文旨在探討klotho基因G395A多態(tài)性與高血壓合并左室肥厚的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 對象 來自于2012年1～8月在鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院門診及住院的原發(fā)性高血壓患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)按照2010年中國高血壓防治指南。所有患者均排除繼發(fā)性高血壓、腦血管病、糖尿病、泌尿系統(tǒng)感染及肝腎功能不全等，且采血前均停用降壓藥物2 w。根據(jù)高血壓患者是否合并左室肥厚，將其分為單純高血壓組(A組，76例)，高血壓合并左室肥厚組(B組，82例)。69例健康成人為對照組(C組)。各組臨床資料見表1。

1.2 方法

1.2.1 左室肥厚診斷依據(jù) 采用東芝240型彩色多普勒超聲儀，由同一操作者按美國超聲協(xié)會推薦的測量方法，連續(xù)測量3個(gè)心動周期的左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、舒張期左室壁厚度(PWT)及舒張期室間隔厚度(IVST)，取其平均值。體表面積(BSA)=〔0.006×身高(cm)+0.012 8×體重(kg)〕-0.152 9。左室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)根據(jù)Devereux公式計(jì)算，即LVMI(g/m2)={0.8 ×1.04〔(LVDd+IVST+PWT)3-LVDd3〕+0.6}/BSA。符合以下一項(xiàng)以上標(biāo)準(zhǔn)者為LVH:(1)PWT≥12 mm;(2)IVST≥12 mm;(3)LVMI男性 ＞125 g/m2，女性＞120 g/m2。

1.2.2 標(biāo)本采集 所有研究對象空腹12 h以上，采集清晨靜脈血5 ml入EDTA抗凝管中，離心10 min(2 000 r/min)，取血漿，-70℃保存。

1.2.3 單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測 DNA提取:采用常規(guī)酚-氯仿法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA，提取試劑盒由大連寶生物工程有限公司提供。引物設(shè)計(jì):通過美國國家生物信息中心的GenBank獲取基因序列及相應(yīng)位點(diǎn)的SNP信息。采用Primer5.0軟件自行設(shè)計(jì)等位基因特異性引物。設(shè)計(jì)一條等位基因特異性上游引物，同時(shí)設(shè)計(jì)一條3'末端堿基與檢測SNP位點(diǎn)的突變型或野生型等位基因堿基互補(bǔ)的下游引物即等位基因特異性下游引物。Klotho基因 G395A上游引物::5'-AATCGGCTCCAGCAATGTCCAG-3'，Tm 60.0℃，GC(%)54.5%;下游引物:如果為G等位基因5'-AGAAAAGTCGCCGACCAACTTTC-3'，Tm 58.4℃，GC(%)47.8%;如果為 A 等位基因 5'-GAGAAAAGGCGACGACCATCTTTT-3'，Tm 58.7℃，GC(%)45.8%。設(shè)計(jì)引物均由中國大連寶生物技術(shù)有限公司合成。PCR采用 20 μl反應(yīng)體系，其中 10 倍緩沖液 2 μl，dNTP 0.125 μmol/L，MgCl22.0 mmol/L，引物濃度為 0.25 μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 IU，Templet DNA 100 ng。反應(yīng)條件為:G等位基因94℃ 5 min預(yù)變性，94℃變性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延長10 min;A等位基因94℃5 min 預(yù)變性，94℃變性 30 s、61℃ 退火 30 s、72℃ 延伸 30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延長10 min。取PCR產(chǎn)物5 μl，1.5%瓊脂糖凝膠-溴乙錠染色法電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀測并記錄結(jié)果。Klotho基因G395A多態(tài)性等位基因型為AA、GA、GG三種形式;其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長147 bp。

1.2.4 生化指標(biāo)檢測 采用日立7600全自動生化分析儀測定血漿總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDLC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、空腹血糖(FPG)、血肌酐(Scr)等生化指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行處理，用Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)樣本的群體代表性;計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。各組基因型及等位基因比較采用χ2檢驗(yàn)及χ2分割檢驗(yàn)，采用Pearson分析相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較 三組間性別、TC、HDL-C、LDL-C、FPG、TG、Scr比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.2 三組klotho基因G395A位點(diǎn)多態(tài)性分析 本研究三組klotho基因型分布符合Haldy-Weinberg平衡。三組間Klotho基因G395A位點(diǎn)的多態(tài)性分布頻率有顯著差異(χ2=16.976，P＜0.05)。單純高血壓組和對照組的基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，A等位基因頻率高于對照組(χ2=3.863，P＜0.05)。高血壓合并左室肥厚組和對照組的基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.307，P＜0.05)，A等位基因頻率高于對照組(χ2=16.314，P＜0.05)。單純高血壓組和高血壓合并左室肥厚組基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，等位基因分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.586，P＜0.05)。見表2。

表1 研究對象一般情況比較(±s)

表1 研究對象一般情況比較(±s)

項(xiàng)目 A組(n=76) B組(n=82) C組(n=69)40/36 44/38 38/31 TC(mmol/L) 4.74±1.03 4.79±1.05 4.69±0.99 LDL-C(mmol/L) 3.09±1.05 3.15±1.03 3.07±1.09 HDL-C(mmol/L) 1.25±0.35 1.23±0.37 1.26±0.38 FPG(mmol/L) 5.59±1.87 5.24±1.99 5.47±2.01 TG(mmol/L) 1.67±1.08 1.65±1.15 1.76±1.26 Scr(μmol/L)性別(男/女)87.98±7.05 92.45±6.78 94.67±7.42

表2 三組基因型及等位基因分布〔n(%)〕

3 討論

Klotho基因是近年來發(fā)現(xiàn)的一個(gè)抗衰老基因，人和小鼠的klotho基因位于染色體13q12區(qū)域，大鼠位于12q12區(qū)域〔4〕。Klotho基因在人體內(nèi)編碼的蛋白分為膜結(jié)合型蛋白和分泌型蛋白兩種，分泌型蛋白的表達(dá)量明顯高于膜型蛋白。Saito等〔5〕利用腺病毒介導(dǎo)將klotho基因?qū)雱用}粥樣硬化模型鼠(OLETF)體內(nèi)(伴有高血壓、高血脂、高血糖、肥胖)，發(fā)現(xiàn)klotho基因可改善血管內(nèi)皮功能，增加一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，降低血壓，防止內(nèi)膜增厚和血管纖維化。血漿NO水平隨著klotho蛋白濃度的升高而增加，兩者存在正相關(guān)。

近年來klotho基因G395A位點(diǎn)多態(tài)性與高血壓的關(guān)系倍受關(guān)注。Wang等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)klotho G395A多態(tài)性與原發(fā)性高血壓密切相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的基因突變可能是該基因表達(dá)的一種潛在調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。Rhee等〔7〕在研究韓國女性G395A位點(diǎn)基因多態(tài)性與高血壓的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)A等位基因攜帶者的收縮壓明顯高于非A等位基因攜帶者，且經(jīng)過體重指數(shù)、年齡校正后仍有顯著差異。本研究發(fā)現(xiàn)，高血壓組A等位基因頻率高于對照組，提示klotoh基因G395A多態(tài)性可能與原發(fā)性高血壓的發(fā)生有關(guān)，AA基因型可能易患高血壓，A等位基因可能是高血壓的易感基因，本研究與Rhee等〔7〕的研究結(jié)果相符。單純高血壓組G等位基因頻率高于高血壓左室肥厚組，提示G等位基因可能對高血壓左室肥厚的發(fā)生具有保護(hù)作用?？傊?，Klotho基因G395A多態(tài)性與原發(fā)性高血壓及左室肥厚的發(fā)生有關(guān)，改變G395A位點(diǎn)的表達(dá)能否減少高血壓、左室肥厚的發(fā)生及其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

1 Kuro-o M，Matsumura Y，Aizawa，H，et al.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling aging〔J〕.Nature，1997;390(6655):45-51.

2 Ong KL，Cheung.BMY，Man YB，et al.Prevalence，awareness，treatment and control of hypertension among United States adults 1994-2004〔J〕.Hypertension，2007;49(1):69-75.

3 Rhee EJ，Oh KW，Yun EJ，et al.Relationship between polymorphisms G395A in promoter and C1818T in exon 4 of the Klotho gene with glucose metabolism and cardiovascular risk factors in Korean women〔J〕.J Endocrinol Invest，2006;29:613-8.

4 Matsumura Y，Aizawa H，Shiraki-Iida T，et al.Identification of the human klotho gene and its two transcripts encoding membrane and secreted klotho protein〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1998;242(3):626-30.

5 Saito Y，Nakamura T，Ohyama Y，et al.In vivo klotho gene delivery protects against endothelial dysfunction in multiple risk factor syndrome〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2000;276(2):767-72.

6 Wang HL，Xu Q，Wang Z，et al.Potential regulatory single nucleotide polymorphism in the promoter of the Klotho gene may be associated with essential hypertension in the Chinese Han population〔J〕.Clin Chim Acta，2010;411(5-6):386-90.

7 Rhee EJ，Oh KW，Lee WY，et al.The differential effects of age on the association of Klotho gene polymorphisms with coronary artery disease〔J〕.Metabolism，2006;55:1344-51.