柳 蔭，吳鳳智，陳 龍，王曉丹，邱樹(shù)毅，周鴻翔*

（貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

近年來(lái)，基因工程學(xué)、分子生物學(xué)和現(xiàn)代分離技術(shù)快速發(fā)展，蛋白質(zhì)也作為一項(xiàng)質(zhì)量和資源評(píng)價(jià)的指標(biāo)[1]，目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的常用方法有凱氏定氮法、考馬斯亮藍(lán)（coomassie brilliant blue，CBB）染色法、紫外分光光度法、雙縮脲法、Folin-酚試劑法（Lowry法）等[2-3]，有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道CBB法優(yōu)于其他的方法[4-7]。

牛血清白蛋白是極為常用的標(biāo)準(zhǔn)參照蛋白，其質(zhì)量限定條件一般要求蛋白質(zhì)含量在80%以上（凱氏定氮法測(cè)定）。在10d～50d范圍內(nèi)，以凱氏定氮法測(cè)定的牛血清白蛋白質(zhì)含量未見(jiàn)明顯規(guī)律性變化，但呈下降趨勢(shì)；而氨基酸含量呈逐漸增加趨勢(shì)，表明在4℃條件下牛血清白蛋白存在降解現(xiàn)象[8-9]。因此，牛血清白蛋白溶液配好盡快做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在利用分光光度計(jì)測(cè)量吸光度值時(shí)，所用的比色皿應(yīng)該是塑料的或玻璃的。并且用之前應(yīng)絕對(duì)保證清洗干凈，禁止使用石英（成分為二氧化硅）比色皿，因?yàn)槿玖蠒?huì)跟二氧化硅發(fā)生共價(jià)結(jié)合[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試樣品為核桃蛋白（實(shí)驗(yàn)室自制）；牛血清白蛋白：購(gòu)于Solarbio公司；考馬斯亮藍(lán)G-250：購(gòu)于Beyotime公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；TDL-40B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；FW177粉粹機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；101-3A鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JA1003N電子精密天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)原理

考馬斯亮藍(lán)G-250存在著紅色和藍(lán)色2種不同的著色形式。蛋白質(zhì)分子具有酰胺基結(jié)構(gòu)，其和蛋白質(zhì)通過(guò)分子間范德華鍵結(jié)合，染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色由紅色形式轉(zhuǎn)變成藍(lán)色形式，最大吸收波長(zhǎng)由465nm變成595nm，通過(guò)測(cè)定波長(zhǎng)595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量[11-13]。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 考馬斯亮藍(lán)G-250的制備[14-15]

精確稱取100.00mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50mL90%vol乙醇中，加入100mL85%的磷酸，用水稀釋至1000mL?？焖龠^(guò)濾后，放在棕色試劑瓶中避光保存。最終試劑中含0.1g/L考馬斯亮藍(lán)G-250，47g/L乙醇，85g/L磷酸。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的制備

結(jié)晶牛血清白蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱式定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度配制成1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.3 供試樣品溶液的制備

精確稱取處理好的核桃粗蛋白粉0.5002g，加入蒸餾水溶解，在室溫條件下攪拌浸提1h，然后3500r/min離心20min，過(guò)濾上清液。然后加少量蒸餾水對(duì)沉淀進(jìn)行再次水提，操作條件與前者相同。合并2次所得的上清液，定容至100mL，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程建立

取9支試管，分別加入0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL的1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，補(bǔ)水至2.0mL。另取9支試管，分別加入0.1mL以上溶液，然后各加入5mL考馬斯亮藍(lán)試劑，充分振蕩混合，10min后于波長(zhǎng)595nm處，以0號(hào)管為空白，測(cè)定各管的吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

得其線性回歸方程式：

Y=0.87249X-0.00056，R2=0.99964，r=0.99982

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Protein standard curve

2.2 供試樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

取樣品溶液0.1mL于試管中，各加入5mL考馬斯亮藍(lán)試劑，充分混合，放置10min，以試劑空白為對(duì)照，波長(zhǎng)595nm處比色，測(cè)定吸光度值。同時(shí)做3個(gè)重復(fù)，測(cè)得吸光度值分別為0.372、0.377、0.345，計(jì)算蛋白質(zhì)含量分別為8.54%、8.66%、7.92%，平均含量為8.37%。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

量取同一樣品溶液0.1mL，每隔5min測(cè)定一次，觀測(cè)其穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of stability experiment

由表1可知，在顯色5min～25min內(nèi)吸光度值比較穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.67%，小于5%，表明穩(wěn)定性較好。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

精確吸取牛血清白蛋白溶液0.1mL進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，連續(xù)測(cè)定其吸光度值6次，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of precision experiment

由表2可知，RSD為1.62%，小于5%，表明精密度較好。

2.5 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

精確吸取來(lái)自同一批原料的試樣，按樣品測(cè)定方法，分別測(cè)定其吸光度值，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of reproducibility experiment

由表3可知，RSD為2.36%，小于5%，表明重現(xiàn)性較好。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

精確吸取已配制的樣品溶液1mL，分別加入0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，加蒸餾水補(bǔ)足至2.0mL，按照樣品測(cè)定法測(cè)吸光度值，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of recovery rate experiment

由表4可知，RSD為2.77%，小于5%，表明該方法準(zhǔn)確度較高，實(shí)驗(yàn)方法可行。

3 結(jié)論

供試樣品溶液中蛋白質(zhì)含量為0.1mg/mL～0.8mg/mL內(nèi)時(shí)，在25min之內(nèi)用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定其中的蛋白質(zhì)含量，方法簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好，對(duì)設(shè)備要求低，是測(cè)定蛋白質(zhì)的有效方法。

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