栗一帆， 王曉娟， 馬晉峰

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是多種原癌基因的活化和多種抑癌基因的失活而造成的，是多種遺傳改變累積的結(jié)果［1］。NET-1是一種屬于四聚體超家族成員的腫瘤增殖相關(guān)蛋白，在胃癌中呈陽(yáng)性表達(dá)，NET-1在胃癌組織中的表達(dá)國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)報(bào)道，且缺乏大樣本量的隨訪觀察［2］。Ki-67是一種公認(rèn)的與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，主要用于判斷細(xì)胞的增殖活性。FHIT基因是一個(gè)抑癌基因，其抑癌機(jī)制可能與抑制細(xì)胞增殖及參與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)［3］。FHIT基因的缺失、異常轉(zhuǎn)錄和異常蛋白的表達(dá)和胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究通過(guò)檢測(cè)胃腺癌組織中NET-1、FHIT、Ki-67的表達(dá)情況，研究 NET-1和Ki-67在胃癌中的表達(dá)是否具有一致性，并觀察三者表達(dá)對(duì)患者生存預(yù)后的影響，為研究胃腺癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后提供可靠的理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

我科2004年5月至2005年1月共手術(shù)治療88例胃腺癌患者，其中男59例，女29例;年齡43～81歲，平均60.1歲;病理診斷均為腺癌，高分化癌10例，中分化癌34例，低分化癌44例;臨床分期Ⅰ期8例，Ⅱ期17例，Ⅲ期43例，Ⅳ期20例。88例患者均無(wú)慢性肝病及肝腎功能不全病史，無(wú)放、化療史，B超及CT檢查未見(jiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶。術(shù)中亦未發(fā)現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)移灶。切除后的所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定后保存。

1.2 試劑與儀器

免疫組化染色試劑盒、NET-1抗體(工作濃度1∶200)購(gòu)于美國(guó) ZYMED公司，鼠抗人Ki-67抗體(工作濃度1∶100)，兔抗人FHIT單克隆抗體(工作濃度1∶50)購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。儀器包括LEICA RM2135切片機(jī)(上海萊卡儀器有限公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。

1.3 方法

1.3.1 檢測(cè)方法 免疫組化二步法:4 μm石蠟切片脫蠟至水。高壓熱抗原修復(fù)，PBS沖洗，每張切片滴加1滴過(guò)氧化物酶阻斷劑，室溫10 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。后經(jīng)非免疫動(dòng)物血清封閉，滴加一抗，4℃冰箱過(guò)夜。滴加生物素標(biāo)記的第二抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的卵白素，室溫下各孵育10 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。

1.3.2 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)的判斷 NET-1免疫染色陽(yáng)性定位于胃癌細(xì)胞胞漿或胞膜，細(xì)顆粒狀。FHIT免疫染色陽(yáng)性定位于胃癌細(xì)胞胞漿，呈棕黃色顆粒。Ki-67陽(yáng)性定位在胃癌細(xì)胞核。結(jié)果的判定采用雙盲法，由兩位有臨床經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行判讀。將染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)二者結(jié)合判斷染色結(jié)果。

1.3.3 術(shù)后生存時(shí)間的收集 術(shù)后第1年每3個(gè)月隨訪1次，術(shù)后2～5年每6個(gè)月隨訪1次。本研究生存時(shí)間收集截至2010年1月。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，平均術(shù)后生存時(shí)間的比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NET-1、FHIT及Ki-67在胃腺癌組織中的表達(dá)

NET-1、FHIT主要表達(dá)在腺癌的細(xì)胞漿(圖1～2)。Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)在腺癌的細(xì)胞核(圖3)。NET-1、FHIT及Ki-67在胃腺癌組織中的檢出率分別為 47.7%(42/88)、40.9%(36/88)及 88.6%(78/88)，見(jiàn)表1。

圖1 NET-1在胃腺癌組織中的表達(dá)(×40)

圖2 FHIT在胃腺癌組織中的表達(dá)(×40)

圖3 Ki-67在胃腺癌組織中的表達(dá)(×40)

表1 3種基因在不同分化程度胃腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率

2.2 胃腺癌組織中NET-1、FHIT及Ki-67的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

NET-1、FHIT及Ki-67陰性表達(dá)組患者的平均術(shù)后生存時(shí)間分別為65.1、26.9、70.1 個(gè)月，陽(yáng)性表達(dá)組患者的平均術(shù)后生存時(shí)間分別為26.6、39.2、30.1個(gè)月(見(jiàn)表2)。NET-1和Ki-67陽(yáng)性表達(dá)患者的術(shù)后生存時(shí)間短于陰性組(P＜0.05)，見(jiàn)圖4、5;FHIT陽(yáng)性表達(dá)患者的術(shù)后生存時(shí)間長(zhǎng)于陰性組(P＜0.05)，見(jiàn)圖 6。

表2 胃腺癌組織中NET-1、FHIT、Ki-67的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

圖4 NET-1陽(yáng)性組與陰性組術(shù)后生存曲線比較

圖5 Ki-67陽(yáng)性組與陰性組術(shù)后生存曲線比較

圖6 FHIT陽(yáng)性組與陰性組術(shù)后生存曲線比較

3 討論

NET-1基因定位于 lp341，其 mRNA全長(zhǎng)為1297 bp，編碼序列為128～853 bp，有241個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框。在 240、692、944、1100、1126 bp 存在變更。NET-1 polyA的位點(diǎn)在1278 bp(基因庫(kù)登記號(hào)碼AF065388)。NET-1作為新的四聚體超家族的成員在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)、粘附、移動(dòng)、增生和分化中起重要作用。Bennett等［4］通過(guò)體外NET-1靶向shRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)在人胃癌細(xì)胞建立體外NET-1基因敲除模型，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)導(dǎo)的NET-1 shRNA的胃癌細(xì)胞導(dǎo)致NET-1 mRNA減少了97%(P＜0.000 1)，胃癌細(xì)胞的遷移減少了24%(P＜0.001)。這表明NET-1在胃癌侵襲機(jī)制中的重要作用。

FHIT基因?qū)儆诮M氨酸三聯(lián)體(histindine triad，HIT)基因家族，其定位于染色體3p14.2，基因組全長(zhǎng)約500 kb，由10個(gè)外顯子組成，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA僅1.1 kb，編碼一個(gè)由147個(gè)氨基酸殘基組成的分子質(zhì)量為16 800的FHIT蛋白。在人體包括心、肝、肺、腎和消化器官等組織中表達(dá)。其失活與許多上皮性惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。FHIT基因在體內(nèi)的具體功能尚未完全闡明。目前有研究者認(rèn)為其參與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)等多環(huán)節(jié)的調(diào)控。Zheng等［5］通過(guò)對(duì)49例正常胃的黏膜層、49例腺瘤組織、84例癌旁組織、249例癌組織免疫組化微點(diǎn)陣檢測(cè)FHIT和PTEN的表達(dá)，結(jié)果顯示FHIT和PTEN在胃癌組織中表達(dá)低于正常胃的黏膜層、癌旁組織和腺瘤組織(P＜0.05)。FHIT和PTEN在胃癌組織中的表達(dá)顯示與胃癌的浸潤(rùn)深度、淋巴管的侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、胃癌分期呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。下調(diào)FHIT和PTEN的表達(dá)會(huì)促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡和增殖的失調(diào)。總之，F(xiàn)HIT是很重要的抑癌基因，F(xiàn)HIT的表達(dá)缺失與胃腺癌的致癌作用、侵襲性、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等緊密相關(guān)。

Ki-67是一種存在于增殖細(xì)胞中的核抗原，其功能與染色質(zhì)相連，與細(xì)胞有絲分裂有關(guān)，是目前應(yīng)用最廣泛的增殖細(xì)胞標(biāo)記之一，表達(dá)范圍覆蓋除G0期以外的各增殖周期細(xì)胞，可用于判斷惡性腫瘤預(yù)后。Zambon等［6］研究表明Ki-67通過(guò)啟動(dòng)近端啟動(dòng)子基因的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞G0到G1期的轉(zhuǎn)變，促進(jìn)活體細(xì)胞三維空間的增殖。目前的研究已發(fā)現(xiàn)在多種實(shí)體惡性腫瘤中Ki-67的表達(dá)遠(yuǎn)高于正常組織，并與惡性腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。

本研究通過(guò)對(duì)胃腺癌組織中NET-1、FHIT、Ki-67蛋白表達(dá)及三者與患者生存預(yù)后的關(guān)系的觀察發(fā)現(xiàn):NET-1、Ki-67是在腫瘤細(xì)胞侵襲及增殖中發(fā)揮重要作用的蛋白分子，高表達(dá)NET-1、Ki-67能明顯減少胃腺癌患者的術(shù)后生存時(shí)間;FHIT作為抑癌基因，其蛋白的高表達(dá)能明顯延長(zhǎng)胃腺癌患者的術(shù)后生存時(shí)間。

浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是造成胃癌患者死亡的主要原因。癌細(xì)胞本身具有的多樣性、異質(zhì)性、時(shí)相性以及種類(lèi)繁多的細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的復(fù)雜性。通過(guò)對(duì)胃腺癌組織中NET-1、FHIT及Ki-67蛋白的表達(dá)情況與術(shù)后生存時(shí)間關(guān)系的研究，將有助于我們進(jìn)一步深入了解腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，并可以為開(kāi)辟腫瘤治療的新途徑，為臨床制定有效合理的綜合治療方案提供可靠的理論依據(jù)。

［1］ Claerhout S，Lim JY，Choi W，et al.Gene expression signature analysis identifies vorinostat as a candidate therapy for gastric cancer［J］.PLoS One，2011，6(9):e24662.

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