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雙相陶瓷生物骨-骨形態(tài)發(fā)生蛋白-堿性成纖維細胞生長因子復(fù)合物修復(fù)股骨頭壞死模型的實驗研究①

2013-09-23 01:54王蕾彭吾訓張愛華鄧進龔躍昆李世和胡蘊玉
中國康復(fù)理論與實踐 2013年5期
關(guān)鍵詞:骨組織界限宿主

王蕾,彭吾訓,張愛華,鄧進,龔躍昆,李世和,胡蘊玉

股骨頭壞死(femoral head necrosis,FHN)的治療一直是國內(nèi)外的一大難題[1]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)具有高效誘導(dǎo)成骨活性[2];堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)能夠促進BMP誘導(dǎo)成骨,而且是一種促血管生長因子[3]。本研究采用豬椎骨為原料制備雙相陶瓷生物骨(biphasic ceramic biologic bone,BCBB),將BMP和bFGF復(fù)合到BCBB支架上[4],并移植到微波滅活建立的兔FHN模型病灶清除區(qū)[5],評價BCBB/BMP/bFGF復(fù)合物對FHN的修復(fù)能力。

1 材料與方法

1.1 BCBB/BMP/bFGF復(fù)合物的制備

參照彭吾訓等的方法制備BCBB。以Ⅰ型膠原修飾BCBB,將BMP和bFGF按比例與BCBB復(fù)合,制備BCBB/BMP/bFGF復(fù)合物[4]。

1.2 實驗動物及分組

新西蘭成年大白兔32只,雌雄不限,平均體重2.9 kg(2.7~3.5 kg),微波55℃滅活10 min建立兔雙側(cè)股骨頭壞死模型[5]。將64側(cè)股骨頭隨機分為4組,每組16側(cè)股骨頭:A組為空白對照;B組植入BCBB/BMP;C組植入BCBB/BMP/bFGF;D組植入自體松質(zhì)骨(髂骨)。

1.3 植入方法

造模后8周,按造模時的手術(shù)入路,刮除股骨頭50%左右松質(zhì)骨,A組不植入任何材料,其余各組按計劃分別植入不同材料。為了避免不同移植物相互作用,在同一只兔的兩側(cè)股骨頭作相同處理。所有動物術(shù)前30 min肌注慶大霉素40,000 U,術(shù)后每天肌注40,000 U,連用3 d。術(shù)后分籠飼養(yǎng)。觀察動物的一般情況、食欲及切口愈合情況。

1.4 取材及觀察指標

分別于術(shù)后2周、4周、8周和12周采用靜脈空氣栓塞分批處死動物,每個時間點每組取材4側(cè)股骨頭,進行大體標本觀察、X線攝片、組織學觀察、血管免疫組織化學染色。

1.4.1 大體及解剖觀察 取材后觀察股骨頭表面情況及有無塌陷變形。沿股骨頭冠狀面剖開,肉眼觀察股骨頭缺損區(qū)修復(fù)情況。

1.4.2 X線攝片 取材后立即行X線攝片,統(tǒng)一攝片條件為60 kV、50 mA、0.12 s。觀察股骨頭缺損區(qū)修復(fù)情況。

1.4.3 組織學觀察和組織學新骨形成面積比較 標本制成5μm厚切片,HE染色,光鏡下觀察。對每個時間點的每個標本隨機選取1張切片,在每張切片的植骨區(qū)(空白組為缺損區(qū))隨機選取3個100倍視野,觀察新骨形成面積。根據(jù)體視學德萊塞原理[6],參照空間內(nèi)某種特征物的面積分數(shù)是其體積分數(shù)的估計,采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)進行圖像分析,測算新骨形成的面積百分比。

1.4.4 血管免疫組織化學染色及血管面積比較 采用CD34單克隆抗體(邁新試劑公司)對2周、4周、8周每個股骨頭的組織切片進行免疫組化染色。常規(guī)石蠟切片厚4μm,按常規(guī)ABC法進行免疫組化染色。陽性染色表現(xiàn)為棕黃色,定位于血管內(nèi)皮細胞胞漿,以已知的陽性組織切片為陽性對照。每個股骨頭隨機選取1張免疫組化染色切片,在每張切片的原缺損區(qū)隨機選取3個100倍視野,采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)測定血管面積百分比。

1.5 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析處理,采用單因素方差分析,顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

所有動物無死亡,術(shù)后當天開始進食,傷口未發(fā)生紅腫、滲出等炎癥反應(yīng),切口Ⅰ期愈合。

2.2 大體解剖觀察

2周時,A組缺損區(qū)為血塊和纖維組織填充;B組BCBB孔隙內(nèi)有組織長入;C組纖維組織長活躍;D組自體骨孔隙內(nèi)和表面有組織生長。4周時,A組缺損區(qū)為纖維組織填充;B組BCBB孔隙內(nèi)長滿組織;C組組織長活躍,顏色紅潤;D組自體骨孔隙內(nèi)和表面長滿組織。8周時,A組缺損區(qū)清晰可見,有1側(cè)股骨頭塌陷;B組BCBB空隙內(nèi)長滿組織,BCBB吸收;C組植骨區(qū)與宿主骨界限模糊;D組植骨區(qū)與宿主骨界限不清。12周時,A組有1側(cè)股骨頭塌陷,缺損區(qū)只有少量類骨組織形成(圖1);B組有大量新骨形成,植骨區(qū)與宿主骨界限依然存在(圖1);C組植骨區(qū)與宿主骨界限不清(圖1);D組植骨區(qū)結(jié)構(gòu)接近宿主骨(圖1)。

2.3 X線攝片

2周時,A組缺損清晰可見;B組骨移植區(qū)呈高密度影;C組骨移植區(qū)高密度影;D組骨移植區(qū)密度與宿主骨相當。4周時,A組缺損略有縮小;B組骨移植區(qū)密度與宿主骨相當;C組骨移植區(qū)密度與宿主骨相當;D組骨移植區(qū)密度低于宿主骨。8周時,A組時缺損仍然存在;B組骨移植區(qū)密度不均;C組骨移植區(qū)與宿主骨界限清楚;D組骨移植區(qū)與宿主骨界限模糊。12周時,A組缺損仍然存在,有1側(cè)股骨頭塌陷(圖2);B組骨移植區(qū)呈高密度影,骨移植區(qū)與宿主骨界限模糊(圖2);C組骨移植區(qū)高密度稍高,骨移植區(qū)與宿主骨界限模糊(圖2);D組骨移植區(qū)密度與宿主骨相當,與宿主骨界限不清(圖2)。

2.4 組織學觀察

2周時,A組以血塊及纖維組織為主;B組纖維組織在BCBB孔隙內(nèi)生長,炎性細胞少;C組纖維組織在BCBB孔隙內(nèi)生長活躍,炎性細胞少;D組纖維組織長入自體松質(zhì)骨孔隙內(nèi),未見炎性細胞。4周時,A組有少量類骨組織形成(圖3);B組有少量新骨組織形成,BCBB吸收不全(圖3);C組有大量新骨組織形成,BCBB吸收不全(圖3);D組有大量新骨組織形成,自體骨移植大部分吸收(圖3)。8周時,A組有類骨組織形成,伴有少量間充質(zhì)干細胞;B組有新骨組織形成,BCBB吸收不全;C組有大量新骨組織和成骨細胞,BCBB吸收不全;D組有大量新骨組織形成,自體骨移植已完全吸收。12周時,A組缺損區(qū)只有類骨組織形成,仍以纖維組織為主;B組BCBB吸收不全;C組骨改建正在進行,植骨區(qū)與宿主骨界限不清,在骨移植區(qū)與宿主骨之間可見連續(xù)骨小梁通過,BCBB吸收不全;D組時骨改建已基本完成,結(jié)構(gòu)接近正常松質(zhì)骨。

圖1 術(shù)后12周大體解剖觀察

圖2 術(shù)后12周X線片

圖3 術(shù)后4周HE染色(100×)

組織學新骨形成面積比較:4周、8周、12周時,D組和C組優(yōu)于B組和A組,B組優(yōu)于A組(P<0.05),C組和D組間無顯著性差異(P>0.05)。見表1。2.5血管免疫組織化學染色

2周、4周和8周時血管免疫組織化學染色顯示,A組、B組、D組血管較少,C組最多,吻合成網(wǎng)(圖4)。2周、4周和8周血管免疫組織化學染色圖像分析結(jié)果顯示,C組血管面積最大,A組最小,C組與A組、B組、D組間比較有顯著性差異(P<0.05),A組、B組、D組間比較無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

3 討論

FHN若不治療,至少有80%在4年內(nèi)會出現(xiàn)塌陷,而單純非手術(shù)治療往往不能阻止這種情況的發(fā)生[1]。由于該病患者大多數(shù)為中青年,行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后遠期效果并不令人滿意[7]。因此,人們更關(guān)注保留股骨頭的療法。保留股骨頭的手術(shù)治療方法包括單純髓腔減壓、髓腔減壓加單純骨移植術(shù)、髓腔減壓加血管束植入或帶血管骨移植術(shù)、截骨術(shù)等。由于各種術(shù)式的療效不一,仍沒有一種滿意的術(shù)式被廣泛接受[8]。

隨著組織工程學的發(fā)展,應(yīng)用骨組織工程技術(shù)修復(fù)FHN有可能成為改善FHN治療效果的一個突破口[8]。BMP和bFGF是近年來研究得較深入的兩種骨生長因子[9]。BMP能夠誘導(dǎo)未分化骨髓干細胞(MSCs)向軟骨母細胞和骨母細胞分化[10],bFGF對已分化的MSCs具有促增殖作用,而且是一強大的血管生長因子[11]。故本研究將BMP和bFGF按比例復(fù)合到BCBB支架上,制備BCBB/BMP/bFGF復(fù)合物[4],并用以修復(fù)兔股骨頭壞死模型。

圖4 術(shù)后2周CD34免疫組化染色(100×)

BCBB用豬椎骨煅燒而成,具有天然網(wǎng)孔系統(tǒng)和一定強度,由79%羥基磷灰石(HA)和17%磷酸三鈣(TCP)組成,HA的含量影響其降解速度[4]。本研究中,BCBB較自體松質(zhì)骨吸收緩慢,這是因為BCBB移植在股骨頭這樣的承重部位,在非承重部位可以增加TCP的含量從而加快材料降解速度。

BMP能夠誘導(dǎo)未分化MSCs向軟骨母細胞和骨母細胞分化[2,12],bFGF對已分化的MSCs具有促增殖作用[3,13-14]。本研究顯示,4周、8周、12周時,C組新骨形成面積大于B組,B組大于A組,表明BMP在體內(nèi)通過誘導(dǎo)未分化MSCs向軟骨母細胞和骨母細胞分化,促進了骨形成。bFGF和BMP具有協(xié)同作用,bFGF通過對已分化的MSCs的促增殖作用,加強了BMP新骨形成作用,BCBB/BMP/bFGF復(fù)合物修復(fù)股骨頭壞死模型的成骨效果優(yōu)于BCBB/BMP。

股骨頭缺血性壞死的主要矛盾是骨缺血[15]。bFGF是強大的血管生長因子[3]。本研究顯示,4周和8周時,C組血管面積大于B組,新骨形成面積也大于B組,提示bFGF發(fā)揮了明顯的再血管化作用,有可能通過促進血管形成,改善股骨頭血供,帶來更多的骨髓基質(zhì)干細胞,從而加速新骨形成和FHN修復(fù);同時,支架材料BCBB是bFGF的良好載體,適合新生血管長入。

自體骨移植被譽為骨移植金標準[1]。本研究顯示,4周、8周和12周時,新骨形成面積C組與D組間無顯著性差異,表明BCBB/BMP/bFGF促進FHN修復(fù)的成骨潛能與自體骨移植相當。

本研究不是股骨頭壞死的病理機制研究,因此采用微波滅活建立股骨頭壞死模型[5,16]。A組的病理經(jīng)過表明,該方法所建立的模型是可行的,單純進行病灶清除而不行植骨治療,不能夠自行修復(fù)。

表1 各組新骨形成面積比較(%)

表2 各組血管面積比較(%)

總之,本研究顯示,采用BCBB/BMP/bFGF復(fù)合物移植,對兔FHN模型骨修復(fù)效果與自體骨移植相當。不足之處在于缺乏細胞免疫和體液免疫等方面觀察。如其安全性得到證實,則有望為臨床上股骨頭壞死的治療提供一種有效方法。

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