石星星，尹柏雙，2，李小波，李志強(qiáng)，王洪斌

（1．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030；2．吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 吉林132101）

鈣離子（Ca2＋）是維持機(jī)體細(xì)胞正常生理功能的重要離子，作為第二信使傳遞信息并調(diào)控一系列生命過(guò)程，如基因轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)的合成與分解，細(xì)胞的生長(zhǎng)等［1］。許多研究表明，鈣離子通過(guò)電壓門控鈣通道內(nèi)流引起突觸體［Ca2＋］i增加，觸發(fā)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放［2］。替來(lái)他明為苯環(huán)己哌啶類靜脈全身麻醉藥，唑拉西泮是苯二氮卓類鎮(zhèn)靜劑，將其1∶1復(fù)合制成Zoletil（歐洲）或 Telazol（美國(guó)）［3］，國(guó)外廣泛應(yīng)用于動(dòng)物的麻醉［4］，其麻醉機(jī)理尚不完全清楚。范宏剛研究表明，隨著替來(lái)他明劑量的增加，丘腦和小腦Ca2＋－Mg2＋－ATP酶活性呈現(xiàn)出劑量依賴性抑制的趨勢(shì)［5］，提示其麻醉作用可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)鈣穩(wěn)態(tài)有關(guān)。本試驗(yàn)通過(guò)研究替來(lái)他明－唑拉西泮合劑對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)突觸體鈣動(dòng)力學(xué)的影響，探討替來(lái)他明－唑拉西泮合劑麻醉與突觸體鈣離子的關(guān)系，探究該藥物的部分全麻分子機(jī)理。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料及動(dòng)物 替來(lái)他明－唑拉西泮，購(gòu)自法國(guó)維克制藥公司；Fluo－3－AM，購(gòu)自 Molecular Probes公司；Triton X－100，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。SD純種大鼠6只，雌雄兼?zhèn)?，體重220±20 g，12～15周齡，購(gòu)自哈爾濱市漢方實(shí)驗(yàn)鼠類養(yǎng)殖所。

1．2 試驗(yàn)分組 試驗(yàn)分為對(duì)照組、低濃度藥物組（替來(lái)他明－唑拉西泮合劑終濃度為100μmol／L）、中濃度藥物組（替來(lái)他明－唑拉西泮合劑終濃度為200μmol／L）、高濃度藥物組（替來(lái)他明－唑拉西泮合劑終濃度為400μmol／L）。

1．3 突觸體的制備 參照Gray和Whittaker的方法［14］，略作修改。簡(jiǎn)述之，取SD大鼠消毒，斷頭處死后迅速分離大腦皮質(zhì)于勻漿器中，按1∶10（W／V）的比例加入預(yù)冷（4℃）的0．32mol／L蔗糖溶液并勻漿。勻漿液1 500r／min離心10min。取上清液緩慢滴加在2mL預(yù)冷的1．2mol／L蔗糖溶液表面，9 000r／min離心20min。緩慢吸取含有突觸體的中間梯度帶，用0．32mol／L蔗糖溶液稀釋3～3．5倍后滴加在8mL預(yù)冷的0．8mol／L蔗糖溶液表面，9 000r／min離心25min。吸取下層液相，加入等體積預(yù)冷的人工腦脊液后20 000r／min離心10 min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的人工腦脊液重懸，放入4℃待用。

1．4 Fluo－3－AM負(fù)載 將制備的突觸體懸浮于人工腦脊液1h后加入鈣熒光指示劑Fluo－3－AM（終濃度為5μmol／L），37℃，避光恒溫振蕩30min。孵育負(fù)載后用人工腦脊液洗滌3次，室溫放置15 min，確保AM體的完全去酯化作用。

1．5 突觸體［Ca2＋］i的檢測(cè) 采用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，激發(fā)光488nm，發(fā)射光530nm。測(cè)樣品熒光值F，再加入終濃度為0．1%Triton X－100測(cè)熒光值Fmax，加入終濃度為5mmol／L的EGTA測(cè)熒光值Fmin，按以下公式求出［Ca2＋］，［Ca2＋］＝iiKd× ［（F－Fmin）／（Fmax－F）］，Kd為400nmol／L。1．6 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，用SPSS 13．0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表1所示。加入替來(lái)他明－唑拉西泮合劑后，突觸體內(nèi)游離鈣離子濃度顯著升高，與對(duì)照組比較差異極顯著（P＜0．01）；隨著替來(lái)他明－唑拉西泮合劑濃度的增加，突觸體內(nèi)游離鈣離子濃度逐漸升高；高濃度組中突觸體內(nèi)游離鈣離子濃度明顯高于中、低濃度組，差異顯著（P＜0．05）；中濃度組與低濃度組間比較差異不顯著（P＞0．05）。

3 討論

鈣離子在神經(jīng)元內(nèi)有發(fā)動(dòng)動(dòng)作電位、節(jié)律性發(fā)放、突觸的生長(zhǎng)、基因表達(dá)和遞質(zhì)釋放等多種功能。鈣離子通過(guò)電壓門控鈣通道進(jìn)入突觸前神經(jīng)末梢引起［Ca2＋］i增加，是調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)釋放的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。具有完整膜結(jié)構(gòu)的突觸體是目前麻醉藥對(duì)突觸前作用的良好研究模型。

表1 替來(lái)他明－唑拉西泮合劑對(duì)大鼠腦皮質(zhì)突觸體鈣離子濃度的影響 （±SD，n＝6）

表1 替來(lái)他明－唑拉西泮合劑對(duì)大鼠腦皮質(zhì)突觸體鈣離子濃度的影響 （±SD，n＝6）

##：藥物組與對(duì)照組比較差異極顯著（P＜0．01）；＊：藥物合劑組間比較差異顯著（P＜0．05）

組別 ［Ca2＋ ］i（nmol／L）對(duì)照組647．62±3．54合劑低劑量組 834．25±11．88##合劑中劑量組 839．44±15．49##合劑高劑量組 1 061．77±10．17##＊

近年來(lái)有關(guān)麻醉劑和突觸鈣離子關(guān)系的報(bào)道結(jié)果不一。張軍（2005）利用依托咪酯研究表明，依托咪酯對(duì)KCl誘發(fā)突觸體內(nèi)鈣離子升高的抑制程度呈濃度依賴性［6］。Ito（2011）等認(rèn)為，異丙酚和苯巴比妥可抑制興奮性突觸前鈣離子的增加，從而影響其神經(jīng)遞質(zhì)的釋放［2］。Fang（1998）對(duì)大鼠大腦皮層游離神經(jīng)元末梢的研究表明，吸入麻醉藥異氟醚和氟烷影響突觸前鈣離子動(dòng)力學(xué)，抑制鈣離子通道，而導(dǎo)致Ca2＋濃度降低［7］。王金波等（2001）研究報(bào)道，異丙酚和異氟醚作用于心肌細(xì)胞膜上的L－型鈣離子通道，抑制鈣離子跨膜內(nèi)流，對(duì)心肌收縮性產(chǎn)生不同程度的影響［8］。國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)替來(lái)他明及唑拉西泮和突觸體內(nèi)鈣離子濃度關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)道。有少量關(guān)于替來(lái)他明及唑拉西泮和神經(jīng)遞質(zhì)關(guān)系的研究。如張燕［9］的研究發(fā)現(xiàn)，替來(lái)他明引起大腦皮層抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ－氨基丁酸（GABA）含量顯著升高。Chaudhary等（2003）認(rèn)為唑拉西泮能促進(jìn)GABA 的釋放［10］。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，替來(lái)他明－唑拉西泮合劑使鈣離子內(nèi)流引起突觸體內(nèi)鈣離子濃度升高，鈣離子作用于突觸囊泡促使抑制性神經(jīng)遞質(zhì)（GABA、Gly）釋放增加，降低突觸后神經(jīng)元的興奮性，發(fā)揮抑制效應(yīng)，使替來(lái)他明－唑拉西泮合劑產(chǎn)生全麻作用。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，替來(lái)他明－唑拉西泮合劑引起大鼠腦神經(jīng)突觸間隙鈣離子內(nèi)流使突觸體內(nèi)鈣離子濃度升高，作為第二信使傳遞麻醉信息，促使突觸囊泡釋放抑制性神經(jīng)遞質(zhì)可能是其產(chǎn)生全麻作用的機(jī)理之一。

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