姜甜甜，張大丙

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流行病學(xué)與人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 海淀100193）

鴨瘟（Duck plague）又稱為鴨病毒性腸炎（Duck viral enterits，DVE），是鴨、鵝、天鵝等的一種急性、接觸傳染性疾病，以血管損傷、組織出血、消化道黏膜糜爛、淋巴器官受損和實(shí)質(zhì)器官退行性病變?yōu)橹饕卣鳎?］。人們習(xí)慣將本病病原稱為鴨瘟病毒（Duck plague virus，DPV）或鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）［1］，但國(guó)際病毒分類委員會(huì)2011年第11次分類報(bào)告已將該病原種名改稱為鴨皰疹病毒1型（Anatid herpesvirus 1，AnHV1）［2］，分類上歸屬于皰疹病毒科、α－皰疹病毒亞科、馬立克氏病毒屬（http：／／ictvonline．org）。AnHV1基因組長(zhǎng)約160kb，約含78個(gè) ORF［3－4］，在已測(cè)序的強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株之間，5個(gè)ORF（UL2、UL12、US10、UL47和 UL41）表現(xiàn)出明顯的序列差異（插入／缺失和堿基置換），提示這5個(gè)ORF可能與毒力有關(guān)，相對(duì)于弱毒疫苗株，強(qiáng)毒株的UL2含有一個(gè)528－bp的插入序列［4］。

為有效防制鴨瘟，20世紀(jì)60年代國(guó)內(nèi)外研究者即已研制了鴨瘟弱毒疫苗和滅活疫苗并應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐［1，5］，我國(guó)使用鴨瘟雞胚化弱毒疫苗和雞胚成纖維細(xì)胞苗防制本?。?］，多年來(lái)的實(shí)踐證明，其效果良好。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，不同的AnHV1毒株毒力有所不同，但免疫學(xué)特性和抗原相關(guān)性似乎相同［1］。

2011年8月和10月，某地區(qū)免疫過(guò)鴨瘟疫苗的14周齡櫻桃谷北京鴨后備種鴨群和1個(gè)50周齡的櫻桃谷北京鴨種鴨群發(fā)病，剖檢可見(jiàn)食道黏膜縱褶和泄殖腔黏膜有鴨瘟的典型出血病變，其他病變包括心外膜有出血點(diǎn)，脾臟發(fā)黑，腸黏膜充血、出血和炎癥，肝臟隱約可見(jiàn)不明顯的出血斑點(diǎn)，從大體病變判斷，頗似鴨瘟。為獲得準(zhǔn)確診斷結(jié)果，并了解免疫鴨群發(fā)病是否因AnHV1變異所致，本文采用PCR方法對(duì)4份肝臟樣品進(jìn)行了分子檢測(cè)，在此基礎(chǔ)上，比較了1株分離株和3個(gè)疫苗株的UL2和糖蛋白編碼基因序列，以期為尋找可能的發(fā)病原因提供信息。

1 材料與方法

1．1 臨床樣品 采集4只病（死）鴨的肝臟，加入磷酸鹽緩沖液研磨成勻漿，12 000r／min離心10min，取上清，用于PCR檢測(cè)和病毒分離。

1．2 參考毒株和參考序列 以3個(gè)不同生產(chǎn)廠家的鴨瘟雞胚化弱毒疫苗或雞胚成纖維細(xì)胞苗凍干制品作為AnHV1參考毒株，分別稱為A株、B株和C株。用滅菌生理鹽水將凍干苗重懸，離心取上清備用。從GenBank下載AnHV1德國(guó)強(qiáng)毒株2085株［4］和中國(guó)弱毒疫苗株VAC株［3］的基因組序列用于引物設(shè)計(jì)和序列比較，序列登錄號(hào)分別為JF999965和EU082088。

1．3 DNA提取 用酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）法提取DNA，用無(wú)水乙醇沉淀DNA，隨后將DNA溶解于雙蒸水。

1．4 臨床樣品的PCR檢測(cè) 為檢測(cè)臨床樣品是否含鴨瘟病毒，用3株疫苗株作為陽(yáng)性對(duì)照，按文獻(xiàn)［7］合成引物P1和P2，經(jīng)PCR檢測(cè) AnHV1的UL6基因，預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為416bp。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括12．5μL 2×NI－TaqPCR Master－Mix（加拿大新產(chǎn)業(yè)公司）、5μL DNA模板、上下游引物（20μmol／L）各1μL和5．5μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min，35個(gè)循環(huán)（94℃50s、54℃90s、72℃ 2min）后，72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1．5 病毒分離 選1份PCR陽(yáng)性樣品進(jìn)行病毒分離。將處理獲得的上清液經(jīng)絨毛尿囊膜接種9日齡鴨胚5枚，每胚接種0．2mL，置37℃溫箱培養(yǎng)，收獲死亡的鴨胚尿囊液、絨毛尿囊膜和胚體，制成勻漿，離心取上清。

1．6 UL2序列的擴(kuò)增 為了解分離株的分子特性，基于AnHV1 2085株和VAC株的基因組序列設(shè)計(jì)引物對(duì)UL2f／UL2r（表1），擴(kuò)增 W1株的UL2及其兩側(cè)序列，用3株疫苗作為弱毒株對(duì)照，W1株和疫苗株的預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為1 311bp和783 bp。PCR反應(yīng)體系見(jiàn)1．4，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，35個(gè)循環(huán)（94℃30s、58℃30s、72℃1min）后，72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1．7 糖蛋白編碼基因的擴(kuò)增 為比較W1株與3株疫苗的糖蛋白編碼基因序列，基于AnHV1 2085株和VAC株的基因組序列合成13對(duì)引物，用于擴(kuò)增W1株與3株疫苗11個(gè)糖蛋白編碼基因，因其中5對(duì)引物擴(kuò)增疫苗株的結(jié)果為陰性，故另外設(shè)計(jì)5對(duì)引物（表1）。PCR體系見(jiàn)1．4，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，35個(gè)循環(huán)（94℃30s、51～60℃30s、72℃2min）后，72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1．8 測(cè)序和序列分析 用膠回收試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）回收PCR產(chǎn)物，連接于pGEM－T載體（Promega），轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α（北京博邁德生物技術(shù)有限公司），鑒定后，由北京擎科公司測(cè)序。

用DNAMAN軟件進(jìn)行序列編輯和ORF預(yù)測(cè)，用BLASTP在GenBank中進(jìn)行序列相似性檢索，用CLUSTALW比較序列同源性。

2 結(jié)果

2．1 PCR檢測(cè) 用引物對(duì)P1和P2經(jīng)PCR檢測(cè)了4份肝臟組織樣品，均擴(kuò)增出預(yù)期長(zhǎng)度的條帶，從3株弱毒疫苗株亦擴(kuò)增出預(yù)期長(zhǎng)度的條帶（圖1）。測(cè)序和序列分析結(jié)果顯示，4份樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物為AnHV1的416bp UL6基因序列，4份樣品的UL6序列與AnHV1 2085株對(duì)應(yīng)序列的同源性為100%，與AnHV1VAC株對(duì)應(yīng)序列的同源性為99%。

2．2 病毒分離 用1份病料接種9日齡鴨胚后7 d，有4枚鴨胚死亡，胚體出血（圖2），收獲接種后72 h死亡的鴨胚，將分離株稱為W1株。

2．3 UL2序列分析 用引物對(duì)UL2F和UL2R經(jīng)PCR從W1株和3株疫苗中均擴(kuò)增出預(yù)期長(zhǎng)度的條帶，如圖3所示，W1株的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 311 bp，該序列與AnHV1 2085株基因組對(duì)應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列同源性為100%；而3株疫苗的產(chǎn)物長(zhǎng)度均為783bp，與AnHV1弱毒疫苗株VAC株基因組對(duì)應(yīng)區(qū)域之間的核苷酸序列同源性皆為99%。

去掉擴(kuò)增產(chǎn)物5′端的157bp序列（79bp UL3和78bp的非編碼區(qū)），獲得 W1株792bp UL2（1～792位）、70bp非編碼區(qū)（793～862位）和292bp UL1（863～1154位）序列以及3株疫苗株的348bp UL2（1～348位）和292bp UL1（335～626位）序列。由此可見(jiàn)，W1株和德國(guó)強(qiáng)毒株2085株的UL2與UL1之間均存在一個(gè)長(zhǎng)度為70bp的非編碼區(qū)，而所測(cè)3株疫苗株與文獻(xiàn)報(bào)道的疫苗VAC株相同，即UL2基因與其下游的UL1基因重疊14個(gè)堿基。

表1 擴(kuò)增AnHV1UL2和糖蛋白編碼基因所用引物

圖1 AnHV1臨床樣品的PCR檢測(cè)

序列比對(duì)結(jié)果顯示，在該區(qū)域，W1株和德國(guó)強(qiáng)毒株2085株均比3株疫苗株長(zhǎng)528bp；疫苗株所缺失的部分對(duì)應(yīng)于 W1株UL2的3′部分（282～792位）和UL2～UL1非編碼區(qū)的5′端（793～809位）。

圖2 ANHV1感染的11日齡死亡鴨胚

圖3 UL2序列的PCR擴(kuò)增

2．4 糖蛋白序列分析 序列分析結(jié)果表明，分離株W1株與疫苗株A株、B株和C株之間gB、gC、gD、gG、gH、gM、gN和gL蛋白的氨基酸序列完全相同，而gE、gI、gK的氨基酸序列同源性為99%（表2）；W1與3株疫苗株之間gE、gI和gK蛋白分別存在2個(gè)（T48I、S451P）、3個(gè)（I168N、S301R、G338D）和1個(gè)（V84A）氨基酸置換。

W1株與文獻(xiàn)報(bào)道的弱毒疫苗株（VAC株）之間糖蛋白gB、gC、gD、gG、gH 和gN的氨基酸序列同源性為100%，gE、gK、gL和gM的氨基酸序列同源性為99%株（Vac株和其他毒株的gI蛋白存在長(zhǎng)度差異）（表2）；W1株與 VAC株之間gE、gK、gL和gM 蛋白分別存在2個(gè) （T48I、S451P）、1個(gè)（V84A）、1個(gè)（G231V）和1個(gè)（V170I）氨基酸置換。

表2 W1株與參考毒株11個(gè)糖蛋白的氨基酸序列同源性 （%）

分離株W1株與德國(guó)強(qiáng)毒株8025株之間gB、gC、gD、gE、gH、gI、gL和gN蛋白的氨基酸序列完全相同，gG、gK和gM蛋白的氨基酸序列同源性為99%（表2）。分離株 W1株與德國(guó)強(qiáng)毒株8025株之間gG、gK和gM蛋白分別存在1個(gè)（C14R）、1個(gè)（V84A）和2個(gè)氨基酸（L23S和H126R）的置換。

3 討論

本次的病例具有鴨瘟的部分典型病變，如食道黏膜縱褶條帶狀出血和泄殖腔黏膜環(huán)狀出血，但還缺乏鴨瘟的其他一些特征性病變，如腺胃和肌胃交界處的灰黃色壞死帶或出血帶、肝臟出血或壞死病變以及腸道的環(huán)狀出血帶等［1］，出現(xiàn)這種相對(duì)不典型的病變可能與進(jìn)行過(guò)疫苗免疫有關(guān)。用PCR可從4份臨床樣品中檢出AnHV1的特異性UL6序列，表明臨床樣品中含有AnHV1；相對(duì)于弱毒疫苗株，分離株W1株的UL2含有一個(gè)528－bp的插入序列，符合AnHV1強(qiáng)毒株的分子特征［4］。據(jù)此可做出診斷，即本次發(fā)病與AnHV1感染有關(guān)。

我國(guó)生產(chǎn)的鴨瘟疫苗具有良好的免疫效果，在防控鴨瘟的過(guò)程中曾發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。一般認(rèn)為，不同的AnHV1毒株毒力不同，但具有共同的免疫學(xué)特性［1］。然而，近年來(lái)，我國(guó)養(yǎng)鴨生產(chǎn)中不時(shí)出現(xiàn)免疫過(guò)鴨瘟弱毒疫苗的鴨群仍發(fā)生鴨瘟的現(xiàn)象，本研究涉及的兩個(gè)鴨群即是如此，是否存在An－HV1流行毒株抗原性變異的情況也是需要考慮的因素。用疫苗進(jìn)行免疫攻毒試驗(yàn)或用中和試驗(yàn)比較野毒與疫苗毒之間的血清學(xué)相關(guān)性無(wú)疑有助于了解免疫鴨群發(fā)生鴨瘟的原因所在，但免疫攻毒試驗(yàn)存在生物安全問(wèn)題，而中和試驗(yàn)則需制備相應(yīng)的抗血清。由于皰疹病毒的囊膜糖蛋白是宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別的主要抗原［8］，因此，測(cè)定并比較野外分離株與弱毒疫苗株的囊膜糖蛋白序列亦可提供有用的線索。

研究結(jié)果表明，AnHV1共編碼11種囊膜糖蛋白，即 gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM 和gN［3－4］。測(cè)序和序列分析顯示，W1株與弱毒疫苗株A株、B株和C株之間共有8個(gè)囊膜糖蛋白（gB、gC、gD、gG、gH、gM、gN和gL）的氨基酸序列完全相同，另外3個(gè)囊膜糖蛋白（gE、gI和gK）的氨基酸序列同源性為99%，這一結(jié)果說(shuō)明，相對(duì)于我國(guó)養(yǎng)鴨生產(chǎn)中常用的弱毒疫苗株，分離株W1株的囊膜糖蛋白序列未發(fā)生明顯的變異。比較W1株和德國(guó)強(qiáng)毒株2085株［4］以及文獻(xiàn)報(bào)道的弱毒疫苗株［3］之間的囊膜糖蛋白序列，亦可看出，不同AnHV1毒株的囊膜糖蛋白序列具有高度的保守性。

對(duì)偽狂犬病病毒、馬立克氏病病毒和單純皰疹病毒的研究表明，gB、gD和gC蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，單純皰疹病毒的gC蛋白還可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)［9－13］。因此，根據(jù) W1株與弱毒疫苗株（A株、B株、C株以及VAC株）之間gB、gC和gD等糖蛋白的氨基酸序列同源性為100%的結(jié)果，可以初步認(rèn)為，本次鴨瘟的發(fā)生與病原的變異無(wú)關(guān)。開(kāi)展更多毒株的監(jiān)測(cè)分析工作將有利于闡明免疫鴨群的發(fā)病原因，而做好鴨瘟疫苗的生產(chǎn)、運(yùn)輸和保存工作并合理使用鴨瘟疫苗對(duì)于發(fā)揮鴨瘟疫苗的免疫效果至關(guān)重要。

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