黎麗雯，潘 綱 ，李 梁 ，李 宏 ，施文卿，張洪剛，朱廣偉

(1:中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所，南京210008)

(2:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京100085)

湖泊水體中的化合態(tài)氮素大部分通過固氮生物和大氣沉降而來，這些化合態(tài)氮素又可以通過水生生物的吸收利用以及微生物的硝化和反硝化作用等轉(zhuǎn)化為生物量或者氮氣從湖泊中去除，從而維持湖泊中氮素循環(huán)的平衡狀態(tài)［1］.但是人類活動，如大規(guī)模的合成氨工業(yè)以及大量施用化肥，使得大量外源性氮素進(jìn)入湖泊，并在湖泊底泥中富集［1-2］.很多研究均已表明，湖泊氮素的增加對于環(huán)境有持久的不良影響，包括污染飲用水、導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化等［2］.淡水的富營養(yǎng)化是全球關(guān)注的熱點問題，湖泊富營養(yǎng)化的典型標(biāo)志之一就是藍(lán)藻的暴發(fā).藻華的暴發(fā)也伴隨著藍(lán)藻在湖體中的自然沉降.在厭氧情況下，除了底泥營養(yǎng)鹽的釋放，藻類殘體的分解也可以產(chǎn)生大量顆粒態(tài)、溶解態(tài)和膠體態(tài)的氮、有機(jī)碳［3］.已有研究表明，美國Narragansett Bay藻量與沉積物中反硝化過程存在相關(guān)關(guān)系［4］.但沉降的藍(lán)藻促進(jìn)反硝化作用的機(jī)制以及如何影響底泥中的C、N未見報道.

反硝化脫氮同物理、化學(xué)除氮法相比，不是將硝酸鹽簡單地濃縮，而是將它轉(zhuǎn)化為N2和N2O，被認(rèn)為是湖泊中去除氮元素的最主要生物途徑［5］.反硝化菌大部分為異養(yǎng)型厭氧微生物，需要碳源提供能量以及電子供體以實現(xiàn)氮素的降解［8］.生物脫氮過程中，電子供體通常來源于可生物降解的溶解性有機(jī)物.在過去的幾十年中，大量的研究嘗試補(bǔ)充各種碳源以促進(jìn)反硝化的進(jìn)行［6-7］.已有研究表明往太湖底泥中添加淀粉和乙酸鈉可促進(jìn)底泥總氮(TN)的去除［6］.但是外加碳源可能會涉及巨大的經(jīng)濟(jì)投入和增加環(huán)境負(fù)擔(dān)［8］.藻細(xì)胞含有比農(nóng)作物更高的脂類、可溶性多糖和蛋白質(zhì)等，已被用于制造生物柴油，也被認(rèn)為是生物可降解的有機(jī)物［9-10］.沉降到底泥中的藍(lán)藻若可以為底泥反硝化菌提供碳源，對充分利用資源和降低成本來說都具有重要意義，但是關(guān)于藍(lán)藻提高底泥反硝化菌脫氮能力的可行性以及其效率的研究很少.

絮凝除藻技術(shù)已被認(rèn)為是一種較好的從水體中去除藻類水華的方法.潘綱等不斷改進(jìn)改性黏土技術(shù)，提出改性當(dāng)?shù)赝寥佬跄寮夹g(shù)(MLS技術(shù)).該技術(shù)利用湖泊周圍易得、無污染、廉價的土壤，通過微生物可降解的殼聚糖改性，可將湖泊中88%TN和89%的藻華去除［11-12］.通過絮凝除藻技術(shù)將藻體從水體中轉(zhuǎn)移至底泥表面，可能會給底泥微生物提供大量的可生物降解有機(jī)碳并且提供電子供體，從而影響微生物的生物地球化學(xué)作用.因此需要研究沉降藻體對底泥微生物活動的影響，為絮凝技術(shù)在湖泊治理中降低氮素的內(nèi)源污染提供新的技術(shù)依據(jù).

本文通過向太湖底泥中添加不同量的藻細(xì)胞以模擬藍(lán)藻沉降后與底泥的混合狀態(tài)，監(jiān)測底泥中TN、pH、Eh、COD、揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)和氮元素轉(zhuǎn)化，研究藻細(xì)胞的存在是否會對底泥中氮去除產(chǎn)生影響，并探究其影響機(jī)制，為富營養(yǎng)化湖泊氮內(nèi)源污染的治理提供新的科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1樣品采集

底泥和藍(lán)藻樣品均采集于太湖北部檀溪灣(31°26'42″N，120°07'49″E)，用柱狀采泥器(有機(jī)玻璃柱，內(nèi)徑8.4 cm，高50 cm)于2012年11月10日采集6個表層10 cm底泥樣品，置于冰盒中送至實驗室，混合均勻后4℃下保存.用浮游植物網(wǎng)收集水體表面藍(lán)藻，置于冰盒中送至實驗室，用0.5%的NaCl溶液清洗3遍后離心富集，冷凍干燥后備用.冷凍干燥是一種可以保證微生物保藏期長、成活率高的干燥方式［13］.采用此種方式可以極大程度地保證細(xì)胞活性、藻體內(nèi)碳素和氮素等成分，將其作為實驗材料盡可能地表達(dá)沉降藍(lán)藻在底泥中的變化以及C、N情況.經(jīng)元素分析儀(Vario ELⅢ)測得底泥中N含量為0.110%，C含量為0.712%;藻粉中N含量為9.679%，C含量為45.807%.

1.2 厭氧培養(yǎng)實驗

為了屏蔽掉天然水體中溶解性碳素和其他物質(zhì)對于實驗的干擾作用，以便更清晰地探究藍(lán)藻作為底泥反硝化菌碳源的效果和機(jī)理，實驗體系為將30 g底泥(干重)和300 ml人工湖水(1 mg/L NH4Cl，1 mg/L KNO3，0.1 mg/L NaNO2)［6］置于500 ml滅菌三角瓶中.1 g藻粉和2 g藻粉分別添加于上述三角瓶體系中構(gòu)成1×藻組和2×藻組;無藻粉添加的上述三角瓶體系構(gòu)成對照組.因土壤部分理化性質(zhì)易受到傳統(tǒng)滅菌方法如高壓高溫滅菌影響［14］，但汞能抑制藻類光合作用，影響葉綠素合成，使藻細(xì)胞發(fā)生畸變并損傷細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增大［15-16］，對土壤微生物有殺滅作用而對土壤理化性質(zhì)影響較?。?7］.因此采用1 g藻粉和0.4 g HgCl2添加于上述三角瓶體系中構(gòu)成滅菌對照組［17］.所有處理均做3次重復(fù).實驗開始前及每次取樣后，向所有處理中通入10 min N2以去除瓶中氧氣，然后橡膠塞密封，置于振蕩培養(yǎng)箱中150轉(zhuǎn)/min，25℃培養(yǎng)21 d.pH和Eh用pH電極測定(Thermo Orion Model 250，USA).定期采集10 ml泥水混合物置于10 ml離心管中，用于COD、TN、化合態(tài)氮素和揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)的測定.

1.3 樣品化學(xué)分析

泥水混合物中TN的測定采用堿性過硫酸鉀消解法［18］.COD用哈希COD測定儀(HACH DRB200，DB2800)測定.各實驗組在泥水混合狀態(tài)下的TN、COD濃度初始值為:對照組TN濃度為15.33 mg/L，COD濃度為32.5 mg/L;滅菌對照組和1×藻組TN濃度均為37.26 mg/L，COD濃度均為99.31 mg/L;2×藻組TN濃度為49.35 mg/L，COD濃度為154.49 mg/L.VFAs采用比色測定法，用不同濃度乙酸溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線［19］.剩余泥水混合物在7000轉(zhuǎn)/min下離心8 min并且通過0.45 μm的針式過濾器用于化合態(tài)氮素和揮發(fā)性脂肪酸的測定.為了維持系統(tǒng)穩(wěn)定性，銨態(tài)氮(-N)、硝態(tài)氮(-N)、亞硝態(tài)氮(NO－2-N)均參照微縮的光度法用酶標(biāo)儀(Varioskan Flash)測定，銨態(tài)氮的測定采用水楊酸-次氯酸鹽光度法，硝態(tài)氮的測定采用鎘還原法，亞硝態(tài)的測定采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法［20-21］.

2 結(jié)果與討論

2.1 底泥TN去除率

圖1 各實驗處理組中底泥TN去除率Fig.1 TN removal ratio of sediments in each system

實驗處于厭氧條件下，底泥中TN的去除主要依靠反硝化過程，用底泥TN的去除率來表征藻增強(qiáng)底泥反硝化的效果［6］.在21 d的實驗里，各實驗處理組的TN去除率如圖1所示.

滅菌對照組在前3 d對TN有一定的去除效果(最高為9.17%)，這可能跟HgCl2殺死微生物需要一定時間有關(guān).添加藻的處理組TN去除率均比對照組和滅菌對照組要高，最高可達(dá)到42.1%，為對照的2.43倍，說明藻的添加促進(jìn)了反硝化反應(yīng)的進(jìn)行.總體上，1×藻組和2×藻組具有相同變化趨勢，1 g和2 g太湖藍(lán)藻生物量作為底泥反硝化菌的碳源以及促進(jìn)反硝化脫氮效率上，不存在顯著差異(t檢驗，P=0.95).

雖然藍(lán)藻細(xì)胞也增加了底泥中氮素的含量，但經(jīng)過21 d實驗后，各實驗組樣品中氮素含量均低于初始濃度，滅菌對照組的TN濃度最高(33.84 mg/L)，其次為2×藻組(28.57 mg/L)，再次是1×藻組(22.00 mg/L)，均高于對照組(12.67 mg/L).通過計算實驗體系中氮素去除量與剩余量的比值可得，1×藻組(69.36%)和2×藻組(72.73%)均大于對照組(20.99%)和滅菌對照組(10.11%).由此可知，添加藍(lán)藻的實驗組顯著提高了底泥微生物的脫氮效率.值得注意的是，本實驗中僅依靠藍(lán)藻對底泥中土著反硝化菌脫氮的促進(jìn)作用，并不能完全去除由于藍(lán)藻添加導(dǎo)致的氮素增量，可能是由于本實驗周期較短(21 d)，而在實際天然湖泊中，底泥微生物的反硝化作用是長時間的持續(xù)過程，只要碳源充足，由沉降藍(lán)藻導(dǎo)致底泥中的碳素增量也可以逐漸被去除.

2.2 COD去除率和Eh變化

COD去除率變化可以用來表征體系中有機(jī)物質(zhì)的降解程度，也間接表征體系中微生物利用碳素的情況.Eh表征氧化還原狀況，它與體系中氧化還原物質(zhì)的含量、溶解氧濃度、酸性物質(zhì)等有關(guān)，與體系的氧化還原反應(yīng)呈正相關(guān)關(guān)系［22］.滅菌對照組中COD濃度幾乎沒有變化，最大去除率僅為2.63%，對照組、2×藻組和1×藻組COD最大去除率分別為14.46%、42.08%和32.93%(圖2A)，說明藻體中高含量的碳素大部分為可生物降解的物質(zhì)，并且在厭氧情況下得到有效分解.前6 d添加藻的處理組COD濃度變化不大，甚至有少量增加，對照組COD濃度減小的速率大于添加藻的處理組，這可能是因為藻體轉(zhuǎn)化為反硝化菌可直接利用的物質(zhì)需要一定的降解時間.第10 d后1×藻組和2×藻組COD濃度持續(xù)降低并且低于對照組，說明異養(yǎng)微生物已經(jīng)開始有效分解藻細(xì)胞.

實驗結(jié)束后，1×藻組(66.61 mg/L)和2×藻組(89.48 mg/L)的COD濃度均高于對照組(27.80 mg/L).計算實驗體系中COD去除量與剩余量的比值可得，1×藻組(48.63%)和2×藻組(72.71%)均大于對照組(15.11%)和滅菌對照組(2.38%).由此可見，在底泥微生物的作用下，藻體中被有效降解的部分比底泥中有效降解的部分大許多，說明藍(lán)藻中可生物利用的部分高于底泥中的有機(jī)質(zhì).根據(jù)文獻(xiàn)可知，藍(lán)藻中的蛋白質(zhì)占藻體干重的30%～70%，脂肪占2%～5%，產(chǎn)生于細(xì)胞外的多糖占16%～41%［23-24］，可生物降解部分占藻體干重的50%～70%，在最佳條件下可達(dá)90%以上［25］，但如何提高其降解率，更好地給底泥中反硝化菌提供能量和電子供體，以促進(jìn)脫氮作用需要進(jìn)一步研究.

滅菌對照組中電位波動較小，一直處于100 mV左右，對照組中電位除了第1 d、第14 d為正值，其他時候處于－7.5～－23.13 mV之間(圖2B).1×藻組和2×藻組電位有相同的變化規(guī)律，其中1×藻組電位略低于2×藻組.當(dāng)藍(lán)藻處于厭氧環(huán)境中，有的以發(fā)酵的形式，分解、利用積累在細(xì)胞體內(nèi)的糖原作為能量來源，從而可以維持其生命活動并生長良好，而生長良好的藻甚至可以產(chǎn)生氧氣，而不具備這種能力的其他藻類在暴露于黑暗、厭氧條件下2～3 h后，細(xì)胞就會死亡和分解［26］.在第 2 ～6 d，1 × 藻組中電位為正值，第2～14 d，2×藻組電位為正值.添加藻的處理組中實驗初期的正電位可能與部分藻在厭氧、黑暗培養(yǎng)條件下持續(xù)存活了一定時間有關(guān).從第14 d開始，添加藻的處理組中電位急劇下降，表明還原反應(yīng)如反硝化過程占居主導(dǎo)地位，藻體迅速降解成為了反硝化菌的電子供體.

2.3 揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)生和pH變化

在反硝化脫氮過程中，能夠直接被反硝化菌利用的只有可溶解性、易生物降解的有機(jī)物，如乙酸、甲酸、丙酸等低分子有機(jī)酸等，其他大分子有機(jī)物和不易生物降解的有機(jī)物必須先轉(zhuǎn)化為低分子有機(jī)酸才能被微生物利用［7］.甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等10個碳原子以下的脂肪酸統(tǒng)稱為揮發(fā)性脂肪酸(VFAs).在厭氧條件下，通過厭氧發(fā)酵將藍(lán)藻中有機(jī)物轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸［27］，從而給反硝化過程提供能量和電子供體.對照組VFAs在初始階段含量高，隨后逐漸減小，而滅菌對照組與添加藻的處理組具有相同規(guī)律，VFAs持續(xù)不斷產(chǎn)生，總體上VFAs含量均高于對照組，并且2×藻組VFAs含量(最高可達(dá)2232.96 μl/L)高于1×藻組(最高可達(dá)1263.36 μl/L)，幾乎與投加量呈正比關(guān)系(圖3A).這表明添加藻可以為底泥中的反硝化菌提供大量的VFAs，為其脫氮活動提供直接碳源，且添加藻量與VFAs含量具有明顯相關(guān)性.實驗開始時，對照組的VFAs含量高于添加藻組和滅菌對照組，這有可能與藻細(xì)胞的吸附作用有關(guān)［28］，而實驗過程中添加藻組(特別是2×藻組)和滅菌對照組中VFAs含量的增加表明，這些體系中VFAs的排放通量大于吸收通量，但具體原因還有待進(jìn)一步研究.在前3 d，滅菌對照組VFAs含量高于添加藻的處理組，這說明VFAs的產(chǎn)生與藻細(xì)胞核微生物的活性有關(guān).在滅菌對照組中因為HgCl2的加入使得藻細(xì)胞在前3 d迅速衰亡，而在添加藻的處理組中藻細(xì)胞是一個逐漸衰亡的過程.滅菌對照組、1×藻組、2×藻組中VFAs含量的波動變化可能與通入N2吹脫掉有關(guān)，使得VFAs含量并未持續(xù)增加.對照組未持續(xù)產(chǎn)生VFAs，故在N2吹脫后，呈現(xiàn)出VFAs濃度下降的趨勢.

圖2 各實驗處理組中COD(A)去除率和電位(B)的變化Fig.2 The changes of COD removal ratio(A)and electric potential(B)in each system

圖3 各實驗處理組中VFAs(A)和pH(B)變化Fig.3 The changes of VFAs content(A)and pH(B)in each system

圖4 各實驗處理組中氮的變化(A:銨態(tài)氮，B:硝態(tài)氮，C:亞硝態(tài)氮)Fig.4 Nitrogen transformations in each system(A:ammonium，B:nitrate，C:nitrite)

pH是控制水-土界面污染物轉(zhuǎn)化機(jī)制的重要因素［29］.對照組中 p H 總體上處于 6 .36～7.42之間;滅菌對照組在前3 d pH從5.78持續(xù)下降，隨后基本保持在4.85左右(圖3B).這可能跟HgCl2加入后產(chǎn)生大量的VFAs，并且微生物失活使得體系中的pH緩沖體系遭到破壞有關(guān).前12 d，添加藻的處理組pH處于對照組和滅菌對照組之間，并且2×藻組的pH比1×藻組的低，這可能與藻的分解產(chǎn)生VFAs以及底泥微生物對pH的緩沖作用有關(guān).隨后，添加藻的處理組的pH發(fā)生逆轉(zhuǎn)，超過了對照組的pH，并且在第18 d和21 d時2×藻組的pH高于1×藻組的pH，這可能與實驗后期產(chǎn)生了大量銨態(tài)氮等堿性物質(zhì)有關(guān).

2.4 化合態(tài)氮素的轉(zhuǎn)化

添加藻的處理組使得體系中的銨態(tài)氮濃度比對照組高，并且2×藻組高于1×藻組(圖4A).銨態(tài)氮的持續(xù)增加同時也解釋了第12 d后添加藻的處理組中pH變高的原因.pH和電位同樣也影響著氮素的種類.在第2～6 d，1×藻組中電位為正值，第2～14 d，2×藻組電位為正值，并且體系中pH保持在弱酸范圍內(nèi)(6.1～7.0)，此時底泥存在著較弱的氧化反應(yīng)和還原反應(yīng).因此，添加藻的處理組中-N濃度先增加再降低并且高于2個對照組，1×藻組最高為3.37 mg/L，2 × 藻組最高為 5 .44 mg/L(圖4B).-N濃度在所有體系中均逐漸降低，并且添加藻的處理組下降幅度最高，說明還原反應(yīng)進(jìn)行得徹底(圖4C).實驗結(jié)果也反映出氮素在沉積物的遷移轉(zhuǎn)化機(jī)制，添加藻的處理組先產(chǎn)生硝態(tài)氮，在厭氧和碳源充足的情況下，反硝化菌再將硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮降解為氣態(tài)氮.

2.5 環(huán)境意義

藻華暴發(fā)的湖泊中必然伴隨著藻類的自然沉降，絮凝除藻技術(shù)在富營養(yǎng)化湖泊治理中的發(fā)展和應(yīng)用更是加大了湖泊底泥中藻細(xì)胞的沉積.大量的沉積藻細(xì)胞經(jīng)過衰亡、腐爛和降解等過程釋放其體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，有可能會導(dǎo)致湖泊底泥中氮素和有機(jī)物的增加，長期積累后可能變成湖泊富營養(yǎng)化的內(nèi)源污染來源之一.而藻細(xì)胞由于含有很高的脂類、多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)已被廣泛研究并被用來提煉生物柴油等可利用生物資源.因此，如果能夠?qū)⒊练e在底泥中的大量藻細(xì)胞進(jìn)行資源化利用，不但能夠降低湖泊內(nèi)源污染的風(fēng)險，而且還能夠為湖泊水生態(tài)系統(tǒng)提供能量來源.本研究通過模擬實驗，探究了厭氧情況下太湖藍(lán)藻沉積對底泥反硝化過程的影響及其機(jī)制，研究證明沉積在底泥中的藍(lán)藻細(xì)胞不但能夠為底泥微生物的反硝化過程提供可利用碳源，而且還能提高底泥脫氮的效率，同時不同的藍(lán)藻沉積量對底泥的物理化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生一定影響.本研究結(jié)果可以為富營養(yǎng)化湖泊尤其是暴發(fā)藍(lán)藻水華的湖泊內(nèi)源氮素污染的治理提供新的思路和理論依據(jù).同時，本研究還發(fā)現(xiàn)沉降藍(lán)藻需要一定時間的降解過程，這也為絮凝除藻技術(shù)的完善提供了思路.如潘綱等［12］提出，絮凝除藻技術(shù)實施后，為了避免營養(yǎng)物質(zhì)從沉降藍(lán)藻和底泥中釋放到水體，需要適當(dāng)?shù)母采w技術(shù)對藻體以及營養(yǎng)鹽進(jìn)行封存，再結(jié)合水草吸收或調(diào)節(jié)底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)來強(qiáng)化硝化-反硝化的共同作用等，最終提高湖泊底泥的脫氮率.但如何提高藍(lán)藻對底泥脫氮的促進(jìn)作用還需要進(jìn)一步進(jìn)行實驗室以及野外原位實驗研究.

3 結(jié)論

1)沉降藻體的降解能夠產(chǎn)生大量的揮發(fā)性脂肪酸，而揮發(fā)性脂肪酸可以直接被反硝化菌利用，使得產(chǎn)生的硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮得以在反硝化菌的作用下還原成N2和N2O，從而提高TN去除率，最高可達(dá)42.1%，為對照組(無添加藍(lán)藻)的2.43倍.

2)沉降藍(lán)藻的生物量影響底泥物理化學(xué)性質(zhì)以及底泥反硝化過程，并且在厭氧、黑暗條件下藻體降解需要一定時間，受到氧環(huán)境、微生物作用強(qiáng)度和降解時間的限制.

3)對底泥土著反硝化菌的促進(jìn)作用不足以全部去除藍(lán)藻自身給沉積物帶來的氮負(fù)荷，沉降的藍(lán)藻可能會使得底泥銨態(tài)氮、COD濃度增加.

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