郭 強(qiáng)

(河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南鄭州450003)

老年咳喘片是《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第九冊(cè)中的品種［1］。本品處方中含有黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、甘草、黃精、淫羊藿、補(bǔ)骨脂等中藥材，其中黃芪為君藥，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血等功效。原標(biāo)準(zhǔn)未建立含量測(cè)定檢測(cè)方法，為進(jìn)一步提高和控制產(chǎn)品質(zhì)量、保證療效，本研究建立了測(cè)定黃芪中黃芪甲苷含量的高效液相色譜檢測(cè)方法。本研究參照《中國(guó)藥典》2010版一部黃芪藥材項(xiàng)下含測(cè)方法［2］，結(jié)合有關(guān)參考文獻(xiàn)［3－10］，采用高效液相色譜法－蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(HPLC-ELSD法)測(cè)定了老年咳喘片中有效成分黃芪中黃芪甲苷的含量。該方法簡(jiǎn)便，快速，靈敏，重復(fù)性好，可用于該產(chǎn)品質(zhì)量控制。

1 藥品、試劑與儀器

老年咳喘片樣品由河南羚銳制藥股份有限公司提供，批號(hào)110104，110105，110106。黃芪甲苷對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，為含量測(cè)定用對(duì)照品，批號(hào)110781－2008613;乙腈，為色譜醇，供流動(dòng)相配制用，Merck公司產(chǎn)品;水為超純水;甲醇、正丁醇、氨水均為分析純。Waters 2695高效液相色譜儀，配四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、Alltech公司ELSD2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器;KQ－300型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(實(shí)驗(yàn)中用Agilent C18，4.6 mm × 250 mm，5 μm)，乙腈 － 水(32∶68)為流動(dòng)相，體積流量 1.0 mL/min，柱溫40℃。理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

在此條件下對(duì)黃芪甲苷對(duì)照品溶液、老年咳喘片供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，HPLC色譜結(jié)果均較為理想，同法制備的老年咳喘片陰性樣品(即不含黃芪藥材的老年咳喘片)測(cè)定結(jié)果則為陰性，即未見與黃芪甲苷對(duì)照品保留時(shí)間相一致的峰，說(shuō)明其他藥材對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

對(duì)照品溶液:精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品10.59 mg，置10 mL量瓶中，加入甲醇溶液使溶解，并稀釋至刻度，搖勻;精密量取2 mL，置5 mL量瓶中，加入甲醇溶液使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1毫升中含黃芪甲苷0.423 6 mg)。

圖1 老年咳喘片HPLC色譜圖

供試品溶液:取本品80片，除去包衣，精密稱定，研細(xì);取細(xì)粉8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中;精密加入甲醇100 mL，密塞，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min;濾過(guò);精密量取續(xù)濾液50 mL，回收甲醇并濃縮至干;殘?jiān)铀?0 mL微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次40 mL;合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次50 mL，棄去氨試液，正丁醇液蒸干;用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取0.423 6 g/L黃芪甲苷對(duì)照品溶液 2，4，8，12，16，20 μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積積分值與進(jìn)樣量取對(duì)數(shù)后進(jìn)行回歸處理，黃芪甲苷在 0.847 2 ～8.472 0 μg 范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系?；貧w方程為:Y=1.445 0X+5.575 0，r=0.999 4。

2.3.2 精密度試驗(yàn)

取同一黃芪甲苷對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，連續(xù)測(cè)定6次(進(jìn)樣量10 μL)，測(cè)得峰面積積分值分別為 10 979 711，10 860 851，10 950 254，10 906 841，10 993 894，10 932 655。結(jié)果平均峰面積積分值為10 937 368，RSD=0.4%(n=6)。結(jié)果表明:該方法精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按上述色譜條件分別在第0，1，3，6，9 h 各進(jìn)樣 1 次，每次進(jìn)樣 10 μL，測(cè)得峰面積積分值分別為3 914 875，3 885 792，3 965 229，3 934 280，4 051 114，結(jié)果平均峰面積積分值為32 36 518，RSD=0.50%(n=5)。結(jié)果表明:供試品溶液在9 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的樣品(批號(hào)為110104)6份，按上述測(cè)定方法試驗(yàn)，結(jié)果測(cè)得每片樣品中含黃芪甲苷分別為0.091，0.093，0.095，0.089，0.090，0.088 mg/片，結(jié)果平均含量為 0.091 mg/片，RSD=2.86%(n=6)。結(jié)果表明:該法重現(xiàn)性較好。

2.3.5 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的本品(批號(hào)110104，黃芪甲苷含量0.092 mg/片)5份，每份約4 g，精密稱定，精密加入1.059 g/L黃芪甲苷對(duì)照品溶液1 mL，按供試品溶液的制備項(xiàng)下方法制備加樣供試品溶液。按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表1。計(jì)算回收率，平均回收率為 98.49%，RSD=3.36%(n=5)。

表1 黃芪甲苷回收率測(cè)定結(jié)果

2.4 樣品含量測(cè)定

按含量測(cè)定方法測(cè)定3批樣品中黃芪甲苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 3批樣品黃芪甲苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本文建立了高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定老年咳喘片中黃芪甲苷含量的方法。該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，快速靈敏，重現(xiàn)性好，可用于該產(chǎn)品定量控制。

3.1 含量測(cè)定方法的建立依據(jù)

黃芪為本方中的君藥，黃芪中黃芪甲苷為其主要特征性有效成分，故選擇黃芪甲苷作為控制本品質(zhì)量的指標(biāo)成分。關(guān)于黃芪甲苷的含量測(cè)定方法已有薄層掃描法、HPLC-UV法、HPLC-ELSD法。這幾種方法中，薄層掃描法靈敏度、重現(xiàn)性都較差，前處理步驟多，干擾因素排除較困難;用HPLC-UV法黃芪甲苷僅在201 nm有較弱的末端吸收，操作條件十分嚴(yán)格，噪音對(duì)結(jié)果影響較大;而HPLC-ELSD法簡(jiǎn)便快速靈敏，克服了前兩法的缺陷，靈敏度高，可作為檢測(cè)黃芪甲苷含量的較為理想的測(cè)定方法。

3.2 提取條件的選擇

取供試品8 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇的量比較了50，100，125 mL，超聲處理時(shí)間比較了20，30，40 min，用水飽和的正丁醇振搖提取3次、6次，結(jié)果表明:在加入100 mL甲醇、超聲處理30 min、用水飽和的正丁醇振搖提取3次的情況下，能夠?qū)ⅫS芪甲苷提取完全。若增加甲醇的加入量、增加超聲處理的時(shí)間、增加水飽和的正丁醇振搖提取的次數(shù)，黃芪甲苷的含量不再增加;若減少甲醇的加入量、減少超聲處理的時(shí)間、減少提取的次數(shù)，均不能將黃芪甲苷充分提取。

［1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑:第九冊(cè)［M］.北京，1994:70.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:一部［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:283.

［3］黃勁通.用HPLC法測(cè)定芪芳?xì)忸w粒(無(wú)糖型)中黃芪甲苷的含量［J］.求醫(yī)問(wèn)藥:下半月，2011，9(10):78.

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