李香串，張海弢

(1.山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西 太原 030006；2.吉林農(nóng)業(yè) 大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

潞黨參四倍體優(yōu)良植株的誘導(dǎo)及鑒定

李香串1*，張海弢2

(1.山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西 太原 030006；2.吉林農(nóng)業(yè) 大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

目的：選育潞黨參新品種，解決生產(chǎn)中產(chǎn)量低和抗逆性差的問題。方法：以秋水仙堿為誘變劑誘導(dǎo)多倍體，結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)，快速有效的繁育出大量的用于選育優(yōu)良黨參的原始材料，通過倍性穩(wěn)定性觀察和田間選育，選出優(yōu)良株系。結(jié)果：制染色體觀察片時(shí)，最佳解離條件為使用藥劑HCl∶45%醋酸(2∶1)，解離20～30 s；最佳染色方法是將0.02%濃度的秋水仙堿添加到無菌培養(yǎng)基中，然后把黨參種子播種該培養(yǎng)基上誘變；在年生長(zhǎng)期內(nèi)，月份不同，制作染色體觀察片的最佳取材時(shí)間不同；鑒定植株是否為四倍體時(shí)，采用直接鑒定和間接鑒定相結(jié)合技術(shù)，既保證鑒定的準(zhǔn)確性，又可以減少工作量。結(jié)論：四倍體技術(shù)在選育倍性穩(wěn)定、性狀優(yōu)良的潞黨參優(yōu)良株系過程中起到關(guān)鍵性的作用。

黨參；四倍體；秋水仙堿濃度；鑒定

黨參為桔?？浦参稂h參Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.、素花黨參CodonopsispilosulaNannf. var.modesta(Nannf.)L.T.Shen或川黨參CodonopsistangshenOliv.的干燥根[1]。在我國(guó)，黨參較之人參其藥源分布廣、產(chǎn)量大，近年來臨床上多以黨參替代日益昂貴的人參，作用平和，且需求呈上升趨勢(shì)[2]。山西為黨參的地道產(chǎn)區(qū)之一[3]，栽培歷史悠久，所產(chǎn)“潞黨”品質(zhì)上乘，但產(chǎn)量較低，病蟲害較多。針對(duì)生產(chǎn)中存在的問題，開展了潞黨參多倍體育種工作，利用四倍體植株巨型性及抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，在保證質(zhì)量的前提下，提高產(chǎn)量。

在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、漁業(yè)、林業(yè)分別對(duì)一些農(nóng)作物、水產(chǎn)品和果樹等成功進(jìn)行多倍體育種研究應(yīng)用[4-5]并獲得巨大效益的現(xiàn)實(shí)情況下，黨參生產(chǎn)也應(yīng)加速步入多倍體栽培育種研究等科學(xué)生產(chǎn)途徑。秋水仙堿是誘導(dǎo)植株多倍體常用的誘變劑，但常規(guī)的生長(zhǎng)點(diǎn)涂抹法、種子或根系浸泡法，在誘變過程中容易產(chǎn)生嵌合體，成功率較低[6]。為此我們對(duì)常規(guī)的方法進(jìn)行了創(chuàng)新，結(jié)合植物組織培養(yǎng)技術(shù)，快速有效地獲得大量四倍體原始材料，又經(jīng)過倍性觀察、田間選育，歷時(shí)十多年成功選育出了倍性穩(wěn)定、性狀優(yōu)良的潞黨參株系，研究成果于2011年7月21日通過鑒定，達(dá)到同類研究的國(guó)際先進(jìn)水平。其中的關(guān)鍵性技術(shù)，對(duì)于其它藥用植物品種快速有效地獲得多倍體種質(zhì)資源具有借鑒作用。

1 材料和方法

1.1種子來源及處理方法

采集黨參Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.成熟的種子，選粒大飽滿的用清水洗凈后，再用飽和漂白粉水溶液消毒30 min，無菌水沖洗4次，在無菌條件下接種在附加蔗糖30 g·L-1，水解乳蛋白500 g·L-1，瓊脂0.75 g·L-1，pH5.8，并分別添加0.0%(對(duì)照)、0.1%、0.02%、0.004%及0.008%濃度的秋水仙堿，分別編為處理1～5。其中，對(duì)照組接種800粒，藥物組共接種1 560粒。

1.2根尖細(xì)胞染色體觀察片的制備

1.2.1解離技術(shù) 在試管苗移栽時(shí)，將幼嫩根尖剪下，先置0.002 mol·L-18-羥基喹啉預(yù)處理1.5～2 h，在0 ℃的條件下用卡諾氏固定液(酒精與冰醋酸比例為3∶1)固定24 h，方法一：使用1 mol·L-1HCl解離，置58～60 ℃水浴鍋中解離，分別解離5，6，7，8，9，10 min，然后用45%醋酸洋紅染色2 h左右；方法二：在60 ℃的條件下用2份1 mol·L-1HCl和1份45%醋酸混合液解離5，12，20，30，40 s，然后用蘇木精染色2 h左右；最后壓片，在顯微鏡下(1 000×)觀察并照像。

1.2.2 取材時(shí)間 從早晨7:00開始到10:00，每30 min取材觀察一次；剪下根尖幼嫩的小白尖、根冠約0.3 cm～0.5 cm，花蕾取綠豆大小樣子，用固定液把材料固定在小瓶中，置于冰箱中冷藏，逐一鏡檢篩選。根據(jù)鏡檢的情況再進(jìn)行復(fù)篩，改為7:30到9:30，每間隔5 min取材一次，用固定液把材料固定在小瓶中，置于冰箱中冷藏，逐一鏡檢篩選，觀察細(xì)胞分裂相。

1.3根尖細(xì)胞染色體檢查

用方法二處理幼苗的根尖，解離時(shí)間20～30 s，在顯微鏡下(1 000×)觀察根尖細(xì)胞染色體并照像。

1.4花粉母細(xì)胞染色體檢查

把經(jīng)過根尖染色體觀察的藥物組4株植株移入大田，與花期進(jìn)行花粉母細(xì)胞染色體檢查，取綠豆大小的花蕾作為形態(tài)指標(biāo)，在0 ℃卡諾氏固定液中固定，2 h后，取其中一個(gè)花藥，置于載玻片上，滴上配好的醋酸洋紅染液，用尖鑷子擠壓后去其花藥的殘壁，加上蓋玻片，用酒精燈微烤1～3下，輕輕壓片，鏡檢觀察并照像。

2 結(jié)果與分析

2.1不同秋水仙堿濃度對(duì)種子發(fā)芽率的影響

種子在培養(yǎng)基中，10 d后開始發(fā)芽，藥物組的種子與對(duì)照組相比發(fā)芽勢(shì)基本相同，但藥物組種子發(fā)芽后生長(zhǎng)極為緩慢，且部分變成褐色，一月后逐漸死亡，而對(duì)照組的種子發(fā)出的芽又細(xì)又高，其結(jié)果見表1。

表1 秋水仙堿對(duì)種子發(fā)芽率的影響

藥物組的種子的發(fā)芽率35.2%遠(yuǎn)低于對(duì)照組72.3%的發(fā)芽率，說明秋水仙堿嚴(yán)重抑制種子的發(fā)芽。而且藥物組種子發(fā)的芽外觀形態(tài)與秋水仙堿濃度的高低有關(guān)系，高濃度培養(yǎng)基上發(fā)出的芽粗而短。

2.2不同秋水仙堿濃度對(duì)四倍體植株獲得的影響

將成熟飽滿的黨參種子播種于含有一定濃度的秋水仙堿的培養(yǎng)基中發(fā)芽，1月后取幼嫩胚軸進(jìn)行愈傷組織的培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)后，經(jīng)過脫分化和再分化誘導(dǎo)出再生植株，經(jīng)過細(xì)胞學(xué)鑒定和形態(tài)觀察研究，篩查出四倍體植株20株，其結(jié)果見表2。

表2 秋水仙堿濃度對(duì)四倍體植株獲得的影響

從表2可以看出：來源于處理3的胚軸再生植株，其四倍體植株較多；結(jié)合觀察6批愈傷組織的繼代培養(yǎng)，愈傷組織的顏色、質(zhì)地、生長(zhǎng)速度和誘導(dǎo)率以及分化情況，使用秋水仙堿誘導(dǎo)黨參四倍體時(shí)，其濃度以0.02%為最好。

2.3不同解離方法對(duì)染色體觀察片制作的影響

在染色體倍性鑒定時(shí)，制作好的染色體觀察片是至關(guān)重要的，而植物材料的解離技術(shù)又是觀察片制作過程的關(guān)鍵技術(shù)之一。不同的植物種類，不同的組織類型和材料大小不同，所需水解時(shí)間也有差別，水解時(shí)間正確，染色體著色較深，細(xì)胞質(zhì)不顯示任何顏色；水解時(shí)間太短，染色體著色淺淡，細(xì)胞質(zhì)顯出擴(kuò)散的顏色，這都給觀察帶來不便，解離所使用的藥劑和最佳解離時(shí)間為關(guān)鍵，對(duì)此進(jìn)行了試驗(yàn)篩選，其結(jié)果見表3和表4。

表3 方法一

由表3可知：①解離時(shí)間短(5～7 min)時(shí)，材料發(fā)硬，在放蓋玻片后材料散不開；解離時(shí)間長(zhǎng)(9～10 min)時(shí)，材料又過軟，細(xì)胞壁已破裂，染色體數(shù)不完整；只有在解離時(shí)間為8 min時(shí)，細(xì)胞壁完整，染色體分布均勻，易于觀察。②此方法適宜制作臨時(shí)觀察片。

表4 方法二

由表4可知：解離時(shí)間短(5 s～10 s)時(shí)，材料發(fā)硬，在放蓋玻片后材料散不開；解離時(shí)間長(zhǎng)(40 s)時(shí)，材料又過軟，細(xì)胞壁已破裂，染色體數(shù)不完整；只有在解離時(shí)間為20 s～30 s時(shí)，細(xì)胞壁完整，染色體分布均勻，易于觀察。

與方法一比較，方法二具有解離時(shí)間短，著色深、不會(huì)因?yàn)闀r(shí)間長(zhǎng)而褪色；此方法更適宜制作永久觀察片。結(jié)果證明方法二，解離時(shí)間短，細(xì)胞形態(tài)完整，易于觀察技術(shù)，易于壓片；而且制出的壓片保存的時(shí)間較長(zhǎng)。

2.4不同月份的最佳取材時(shí)間

再生植株經(jīng)過煉苗移栽到田間后，在年生長(zhǎng)周期內(nèi)觀察染色體時(shí)，取材時(shí)間是關(guān)鍵，以能觀察到染色體的分裂相為依據(jù)，根據(jù)鏡檢時(shí)是否能觀察到細(xì)胞分裂相為依據(jù)，確定了黨參在年生長(zhǎng)周期內(nèi)，不同生長(zhǎng)月份其細(xì)胞觀察的最佳取材時(shí)間，其結(jié)果見表5。

表5 不同月份的最佳取材時(shí)間

由表5可知：在年生長(zhǎng)周期內(nèi)，月份不同，黨參植株處于不同的生長(zhǎng)階段，做鏡檢時(shí)取材時(shí)間應(yīng)有所不同。為了制作出含有細(xì)胞分裂相的染色體觀察片，應(yīng)根據(jù)表4選擇最佳時(shí)間取材。

2.5 間接鑒定和直接鑒定

2.5.1間接鑒定 間接鑒定的方法簡(jiǎn)單易行，而且可靠性也很大，植物變成多倍體后，整個(gè)植株呈現(xiàn)巨大型，莖變粗短，葉片變厚，花朵果實(shí)和種子變大，結(jié)實(shí)率低，同時(shí)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞變大、密度小，保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體變多，花粉粒變大，無效花粉增多，生育期延長(zhǎng)，這些特征可以作為判斷多倍體的根據(jù)。本文對(duì)黨參的植物外觀形態(tài)，氣孔的形態(tài)、數(shù)量，葉片的大小及顏色，花蕾大小及花朵數(shù)進(jìn)行比較，其結(jié)果見圖1a～e。

2.5.1.1從試管移栽到盆內(nèi)煉苗的四倍體和二倍體的植株，二者比較四倍體植株的葉子較大、顏色較深，莖也較二倍體的略粗。

2.5.1.2顯微觀察四倍體植株葉片的氣孔明顯大于二倍體，而且氣孔大小統(tǒng)計(jì)處理差異極為顯著[7]；觀察的每視野中，四倍體植株的氣孔數(shù)明顯少于二倍體。

2.5.1.3試管小苗移入花盆后，生長(zhǎng)1-2月后，四倍體與二倍體植株的性狀差異逐漸明顯，黨參四倍體植株葉片的色澤較二倍體綠深，葉脈較二倍體粗且明顯。

2.5.1.4四倍體花蕾及花朵明顯較二倍體的大，觀察還發(fā)現(xiàn)四倍體的植株花朵數(shù)略少于二倍體，花期略長(zhǎng)。

2.5.2直接鑒定 通過檢查花粉母細(xì)胞或根尖細(xì)胞內(nèi)的染色體是否加倍加以判斷，這是最可靠的根據(jù)；

2.5.2.1根尖細(xì)胞內(nèi)的染色體：檢查了藥物組的植株4株，均為四倍體，即2n=4x=32；對(duì)照組檢查5株，均為二倍體，即2n=2x=16(圖1 f、g)(每株觀察50個(gè)以上中期染色體)。檢查了藥物組的植株4株，均為四倍體，即2n=4x=32；對(duì)照組檢查5株，均為二倍體，即2n=2x=16(圖7)(每株觀察50個(gè)以上中期染色體)。

2.5.2.2花粉母細(xì)胞染色體檢查： 觀察到的花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂兩個(gè)不同時(shí)期，即后期Ⅰ和后期Ⅱ，小孢子染色體數(shù)目均為16(圖h、i)，此觀察與原根尖鑒定結(jié)果是一致的。

圖1 四倍體與二倍體的比較

3 討論

3.1本文采用的新方法是將黨參種子接種在含有0.02%秋水仙堿培養(yǎng)基上發(fā)芽，藥劑濃度恒定，不受外界環(huán)境和植株細(xì)胞分裂周期高峰的，在自然狀態(tài)下，使藥液浸入細(xì)胞的時(shí)間、濃度與其細(xì)胞分裂周期高峰的時(shí)間達(dá)到最佳的吻合點(diǎn)，使黨參種子在發(fā)芽過程中逐漸誘變加倍，多倍體誘導(dǎo)成功率高。在秋水仙堿誘變多倍體時(shí)，必須同時(shí)研究藥劑濃度、處理時(shí)間、細(xì)胞分裂時(shí)期和植物的生長(zhǎng)狀況四個(gè)方面因素，才能獲得多倍體，而且處理時(shí)所采用的適宜的濃度和適當(dāng)?shù)奶幚頃r(shí)間是關(guān)鍵，處理時(shí)間愈早，獲得全株為四倍體細(xì)胞的數(shù)目就愈多，處理時(shí)間愈遲，所得的結(jié)果則大多是混雜的。本誘變新方法，使種子在發(fā)芽過程中逐漸誘變加倍，有效的解決了處理時(shí)間的問題。這種新的誘變方法，具有操作簡(jiǎn)單、誘變率高、四倍體純度高、可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)。

3.2為了制作出好的黨參染色體觀察片，最佳方法為：將幼嫩根尖先置0.002 mol·L-18-羥基喹啉預(yù)處理1.5～2h，在0℃的條件下用卡諾氏固定液(酒精與冰醋酸比例為3∶1)固定24 h，并在60℃的條件下用2份1 mol·L-1HCl和1份45%醋酸混合液解離20～30s后壓片、照相。減數(shù)分裂過程中，第一次分裂以計(jì)數(shù)和觀察單個(gè)染色體的形態(tài)和行為為主，一般需要重壓，而第二次分裂則需要保持細(xì)胞完整性，一般需要輕壓。

3.3四倍體鑒定方法的研究，本方法是先間接鑒定，對(duì)初步判斷為多倍體的植株再進(jìn)行直接鑒定，具有保證鑒定質(zhì)量同時(shí)，減少工作量。四倍體植物形態(tài)上與二倍體比較有明顯差別，如根、莖生長(zhǎng)速度略慢，但較二倍體粗壯；葉色深綠、葉形寬短；花朵數(shù)略少于二倍體，花期略長(zhǎng)等特點(diǎn)；且生長(zhǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，上述差異越明顯。間接鑒定說明符合多倍體的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律和多倍體的判斷標(biāo)準(zhǔn)。判斷某個(gè)體是否同源多倍體，可以首先檢查它的氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞是否比二倍體的大，單位面積內(nèi)的氣孔數(shù)是否比二倍體的少，而黨參四倍體測(cè)得結(jié)果表明，觀察視野內(nèi)氣孔數(shù)目少，平均氣孔大，符合多倍體的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律和多倍體的判斷標(biāo)準(zhǔn)。用秋水仙堿加倍的同源四倍體已被證明其性細(xì)胞、體細(xì)胞倍性是穩(wěn)定的，所以采用各株四倍體進(jìn)行增殖，為選用優(yōu)質(zhì)黨參提供了珍貴的原始材料，有可能選出新的品種后，生產(chǎn)應(yīng)用上將有很大的潛力。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：264.

[2] 陳素萍.黨參多倍體植株二代的形態(tài)及細(xì)胞學(xué)觀察[J].科技情報(bào)開發(fā)與經(jīng)濟(jì)，2010，20(34)：177-178.

[3] 劉德軍，路濤.黨參[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2001.

[4] 彭靜，魏岳榮，熊興華.植物多倍體育種研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26(11)：45-49.

[5] 聶振朋，溫明霞，徐建國(guó)，等.果樹多倍體育種研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2007，(23)：17-18.

[6] 上海市農(nóng)科院園藝所.育種探索[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1978.

[7] 陳素萍，王莉，宋秀清.黨參多倍體育種研究[J].中草藥，1991，22(5)：224-227.

更正

發(fā)表在《中國(guó)現(xiàn)代中藥》2013年第15卷第4期的《國(guó)產(chǎn)西洋參生產(chǎn)及商品規(guī)格質(zhì)量的調(diào)查分析》一文的表3中，一等品西洋參總皂苷含量55%實(shí)屬筆誤(見327頁(yè))，應(yīng)為5.5%。特此更正。

作者 周海燕

2013年5月1日

InductionandIdentificationofTetraploidCodonopsispilosula(Franch.)Nannf.

LI Xiang-chuan1*，ZHANG Hai-tao2

InstituteofMedicineandLifeSciencesofShanxiProvince，Taiyuan，030006,China; 2.CollegeofChineseMedicinalMaterial，JilinAgriculturalUniversity，JilinChangchun130118，China)

Objective：To explore the method for induction and identification of tetraploidCodonopsispilosula，therefore setting up the basis on the breeding of new cultivars with high-quality and high resistance to biotic or abiotic stress.Methods：Seeds ofC.pilosulawere treated with colchicine.After germination，hypocotyls were selected for culture，and then the regenerated plants were screened by counting the number of chromosomes to find tetraploid strains.Results：The optimal concentration of colchicine for induction is 0.02%； the optimal solution for dissociation of cells in root ti Pis a mixture of hydrochloric acid and acetic acid(45%)with a radio of 2∶1，and the optimal dissociation time is 20-30 s； the optimal sampling time for chromosome counting in a day depends on the month for sample collection； combination of direct and indirect identification technologies can ensure the accuracy of identification and reduce the redundancy of task.Conclusion：The technologies for induction and identification of tetraploidC.pilosulawill play a key role in breeding of new cultivars with ploidy stability and high-quality.

Codonopsispilosula；tetraploidy；colchicine；identification

2012-11-27)

*

李香串，Tel:(0351)7241446， E-mail: lxch629@163.com