朱煒 陳啟航 董志君 孫慧儀 孟子卓 陳曦 陶婧婷 于曉南

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083)

中國(guó)是野生芍藥的分布中心，共有7種2亞種，約占芍藥組(Sect.Paeonia)植物的1/3[1]。近年來(lái)，我國(guó)研究者對(duì)芍藥組植物的重視程度逐漸增加，但目前國(guó)內(nèi)對(duì)于芍藥組植物的新品種選育工作還不足，豐富的種質(zhì)資源未得到充分的利用[2]。截至2020年10月，芍藥屬植物國(guó)際登錄權(quán)威美國(guó)芍藥牡丹協(xié)會(huì)共登錄了芍藥品種5 200多個(gè)，其中中國(guó)登錄的芍藥品種僅25個(gè)，說(shuō)明我們國(guó)家的芍藥品種的選育水平與歐美國(guó)家還存在較大的差距。

定向雜交，尤其是遠(yuǎn)緣雜交，是園林植物種質(zhì)創(chuàng)新的重要途徑[3]，亦是芍藥屬植物育種的最主要方式[2]。芍藥組野生種存在二倍體和四倍體的倍性分化，經(jīng)過(guò)雜交選育獲得的芍藥品種倍性豐富，存在二倍體、三倍體和四倍體[4-5]。多倍體植株通常具有莖稈粗壯、花色艷麗、花瓣增多、葉片肥厚、抗性強(qiáng)等特點(diǎn)。不同倍性植物雜交是多倍體和非整倍體種質(zhì)創(chuàng)造的一種重要手段。然而，不同倍性植物雜交存在一定的親和性障礙。目前，在蘭花[6-7]、萱草[8-9]、紫薇[10]、石竹[11-12]、百合[13-14]等觀賞植物中對(duì)不同倍性雜交親和性及子代倍性分離已有一些研究報(bào)道。芍藥屬植物雜交親和性研究主要集中在同倍性的牡丹亞組間雜交[15-16]、組間雜交[17-18]和芍藥組內(nèi)雜交[19-20]，對(duì)于不同倍性芍藥品種的雜交親和性及后代倍性的分離規(guī)律鮮見(jiàn)報(bào)道[21]。

本研究以16個(gè)芍藥品種為親本，設(shè)計(jì)不同倍性組合的雜交試驗(yàn)，研究不同倍性芍藥品種間雜交的親和性，并對(duì)部分子代的染色體數(shù)目進(jìn)行鑒定，以期為芍藥定向育種、多倍體種質(zhì)創(chuàng)新提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

選取16個(gè)芍藥品種(表1)，統(tǒng)一種植在國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心北京市小湯山基地，常規(guī)田間管理。選擇生長(zhǎng)勢(shì)基本一致、健壯、無(wú)病蟲(chóng)害植株作為試驗(yàn)材料。親本材料的倍性信息參照前人研究結(jié)果[4，18，22-23]。

1.1 雜交試驗(yàn)

根據(jù)品種的生物學(xué)特性，共設(shè)計(jì)不同倍性雜交組合42組。雜交試驗(yàn)于2017年4月底至5月底進(jìn)行，雜交授粉方法參照劉建鑫等[18]。

1.2 雜交親和性

待芍藥果莢變?yōu)樾伏S色時(shí)采收，獲得種子，計(jì)算結(jié)實(shí)率。通過(guò)水選法篩選得到有胚種子，計(jì)算有胚率。對(duì)有胚種子沙藏處理，待胚根突破種皮時(shí)大田播種，翌年5月計(jì)算出苗率。最終，計(jì)算雜交組合的親和性指數(shù)，以此作為雜交親和性的指標(biāo)。其中：結(jié)實(shí)率=(結(jié)實(shí)朵數(shù)/授粉朵數(shù))×100%，有胚率=(有胚種子數(shù)/種子總數(shù))×100%，出苗率=(出苗數(shù)/有胚種子數(shù))×100%，單果種子數(shù)=種子總數(shù)/授粉朵數(shù)，親和性指數(shù)=單果種子數(shù)×有胚率×出苗率。

1.3 雜交后代倍性鑒定

采用根尖壓片法對(duì)獲得的部分雜交后代進(jìn)行倍性鑒定。倍性鑒定材料選取和處理參照朱煒等[23]的方法。染色體條數(shù)鑒定參照李懋學(xué)等[24]的標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用WPS Office軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Adobe Photoshop CS6對(duì)圖片進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 以二倍體為母本的雜交

以二倍體芍藥品種為母本，共設(shè)計(jì)雜交組合15組，雜交739朵花，獲得后代212株(表2)。從表2中可以看出，同一類倍性雜交組合中不同親本組合結(jié)實(shí)率、單果種子數(shù)、有胚率及出苗率均存在較大差異。在二倍體×二倍體中，結(jié)實(shí)率和單果種子數(shù)最高的組合均為203，分別為90.00%和18.1；有胚率和出苗率最高的組合為202，分別為99.31%和38.89%。在二倍體×四倍體中，結(jié)實(shí)率和單果種子數(shù)最高的組合均為215，分別為97.50%和10.6；有胚率最高的組合為212，有胚率為29.74%；出苗率最高的組合為209，出苗率為66.67%。二倍體品種LT作為母本，與二倍體、四倍體品種雜交，結(jié)實(shí)率均最高，是較好的育種母本材料。

2.2 以三倍體為母本的雜交

以三倍體品種為母本，共設(shè)計(jì)雜交組合12組，雜交433朵花，獲得后代3株(表3)。從表3可以看出，以三倍體品種為母本，結(jié)實(shí)率、單果種子數(shù)均普遍較低，即使獲得種子，大部分組合的有胚率或出苗率也為0，最終僅獲得3株后代。其中，三倍體×二倍體中結(jié)實(shí)率最高的組合為304，結(jié)實(shí)率20.00%，單果種子數(shù)為0.4；三倍體×四倍體中結(jié)實(shí)率最高的組合為305，結(jié)實(shí)率為38.81%，單果種子數(shù)為0.6。組合304和305的母本均為CH，說(shuō)明三倍體品種CH可以作為母本獲得種子并得到后代，是一個(gè)創(chuàng)造新種質(zhì)的好材料。

表3 以三倍體芍藥為母本的雜交結(jié)果

2.3 以四倍體為母本的雜交

以四倍體品種為母本，共設(shè)計(jì)雜交組合17組，獲得雜交苗共173株(表4)。從表4可以看出，同一類倍性雜交組合中不同親本組合結(jié)實(shí)率、單果種子數(shù)、有胚率和出苗率均存在較大差異。四倍體×二倍體中組合402的結(jié)實(shí)率、單果種子數(shù)、有胚率和出苗率均為最高，分別為95.00%、4.9、18.37%和5.56%；組合405和406結(jié)實(shí)率最低，均為0。四倍體×四倍體中組合410結(jié)實(shí)率和單果種子數(shù)均最高，分別為100.00%和7.3；組合413有胚率最高，為100.00%；組合407出苗率最高，為35.28%。四倍體品種SOH、GP作為母本不論與二倍體還是四倍體雜交，結(jié)實(shí)率均為0，說(shuō)明在多倍體雜交育種中SOH、GP均不適宜作為母本。

表4 以四倍體芍藥為母本的雜交結(jié)果

2.4 不同倍性品種雜交親和性比較

從表5可以發(fā)現(xiàn)，在以二倍體為母本的組合中，二倍體×二倍體組合的平均單果種子數(shù)、平均有胚率和平均出苗率均顯著高于二倍體×四倍體組合，其中平均有胚率的差異最為顯著。在以三倍體為母本的組合中，三倍體×二倍體組合的平均單果種子數(shù)與三倍體×四倍體組合接近，平均有胚率顯著高于后者，但前者的出苗率為零，未獲得后代，說(shuō)明在育種中以三倍體為母本時(shí)，應(yīng)該選擇四倍體作為父本。在以四倍體為母本時(shí)，四倍體×四倍體組合的平均單果種子數(shù)、平均有胚率和平均出苗率均顯著高于四倍體×二倍體組合。綜合3項(xiàng)指標(biāo)，計(jì)算各類雜交組合親和性指數(shù)，6類雜交組合的親和性由大到小為：二倍體×二倍體、四倍體×四倍體、二倍體×四倍體、四倍體×二倍體、三倍體×四倍體、三倍體×二倍體。

表5 不同父本、母本倍性品種雜交后親和性

2.5 雜交后代染色體倍性鑒定

通過(guò)根尖壓片法鑒定獲得的部分子代倍性(表6)。二倍體×二倍體的后代染色體數(shù)均為10條，為二倍體(圖1a)；二倍體×四倍體的后代染色體數(shù)目表現(xiàn)多樣，有10，15和20條3種情況，共鑒定出30株二倍體(圖1b)，11株三倍體(圖1cd)，3株四倍體(圖1e)；三倍體×四倍體的后代均為四倍體(圖1f)，未檢測(cè)到非整倍體；四倍體×二倍體的唯一的1株后代鑒定為非整倍體(圖1g)，染色體數(shù)目為2n=3x+1=16；四倍體×四倍體的后代均為四倍體(圖1h)，未發(fā)現(xiàn)其他倍性結(jié)果。

表6 部分子代倍性

a.組合203子代2n=2x=10；b.組合213子代2n=2x=10；c、d.組合213子代2n=3x=15；e.組合214子代2n=4x=20；f.組合305子代2n=4x=20；g.組合402子代2n=3x+1=16；h.組合407子代2n=4x=20。

3 結(jié)論與討論

染色體倍性對(duì)植物雜交親和性具有直接的影響[25]。本研究中，不同倍性芍藥親和性由大到小為：二倍體×二倍體、四倍體×四倍體、二倍體×四倍體、四倍體×二倍體、三倍體×四倍體、三倍體×二倍體。相同倍性品種間雜交具有較高的親和性，其中二倍體×二倍體的親和性高于四倍體×四倍體，這可能是四倍體大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中染色體更容易發(fā)生異常行為所致。二倍體×四倍體單果種子數(shù)要高于四倍體×四倍體，但是二倍體×四倍體的有胚率非常低，所以二倍體×四倍體的雜交親和性要低于四倍體×四倍體。不同倍性雜交親和性研究在其他物種中早有報(bào)道，但因材料的不同雜交親和性結(jié)果也存在一些差異。本研究中二倍體×四倍體的單果種子數(shù)、有胚率和出苗率均顯著高于四倍體×二倍體，說(shuō)明在培育三倍體芍藥時(shí)應(yīng)該以二倍體做母本，這與郭印山等[26]對(duì)2n和4n葡萄雜交組合的親和性研究的結(jié)果一致。王滑等[10]以紫薇為材料研究不同倍性雜交的親和性，結(jié)果顯示二倍體與四倍體的雜交中，四倍體作為母本的親和性更高，與本研究結(jié)果不一致。在以三倍體為母本的雜交試驗(yàn)中，三倍體×四倍體親和性高于三倍體×二倍體，與袁國(guó)良[27]以三倍體LAA百合做母本，與二倍體和四倍體亞洲百合雜交結(jié)果一致。

Johnston et al.[28]提出的胚乳平衡數(shù)(EBN)假說(shuō)認(rèn)為在雜交中當(dāng)胚乳母本與父本基因組比率偏離2∶1時(shí)，胚乳將發(fā)育異常，導(dǎo)致種子敗育。本研究二倍體×四倍體和四倍體×二倍體組合雜交種子中，胚乳的母本與父本基因組比值分別為1∶1和4∶1，故種子敗育嚴(yán)重。而四倍體×二倍體親和性要低于二倍體×四倍體，可能是由于芍藥四倍體品種為異源多倍體，形成的胚珠數(shù)量有限且育性較低，最終導(dǎo)致二倍體×四倍體獲得的種子和后代植株比四倍體×二倍體要多。

Stebbins[29]基于形態(tài)性狀的比較和減數(shù)分裂的觀察，認(rèn)為芍藥組內(nèi)大多數(shù)四倍體類群可能是異源四倍體。而雜種芍藥品種群中的多倍體均由兩個(gè)及以上種源組成，故屬于異源多倍體品種。前人研究表明，三倍體可產(chǎn)生可育的雌配子，作為母本與合適的父本雜交獲得后代[30-31]。本研究中篩選出一個(gè)作為母本育性較好的三倍體品種‘Chalice’，其育性機(jī)理有待進(jìn)一步研究。四倍體植株是獲得多倍體種質(zhì)的重要親本材料。本研究發(fā)現(xiàn)4個(gè)四倍體品種‘Old Faithful’、‘May Lilac’、‘Cream Delight’和‘Roy Pehrson Best Yellow’不論作為父本或母本都具有較好的育性，是芍藥多倍體育種的重要種質(zhì)資源。研究還發(fā)現(xiàn)2個(gè)四倍體品種‘Garden Peace’和‘Scarlet O’Hara’僅適合作為父本，作為母本不結(jié)實(shí)，可能是無(wú)法形成正常的雌配子，其雌配子敗育的原因有待進(jìn)一步研究。

本研究中，相同倍性的雜交組合二倍體×二倍體和四倍體×四倍體后代染色體均保持與父母本相同的倍性，說(shuō)明在芍藥中染色體數(shù)目遺傳相對(duì)較穩(wěn)定，這與周建金等[6]對(duì)不同倍性蝴蝶蘭雜交后代的染色體倍性鑒定結(jié)果不一致。本研究二倍體×四倍體組合產(chǎn)生了二倍體、三倍體和四倍體，與周建金等[6]研究結(jié)果一致，二倍體的產(chǎn)生可能是四倍體父本減數(shù)分裂異常產(chǎn)生了具有活力的雄配子，四倍體的形成可能是二倍體母本產(chǎn)生了未減數(shù)雌配子。袁國(guó)良[27]對(duì)百合三倍體×四倍體的雜交子代進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)均為非整倍體。而本研究中三倍體×四倍體產(chǎn)生的后代均為四倍體，未發(fā)現(xiàn)非整倍體，可能是三倍體母本產(chǎn)生的有活力的二倍體雌配子更容易與四倍體產(chǎn)生的二倍體雄配子結(jié)合。芍藥屬植物染色體屬于大型染色體，數(shù)目較少，基數(shù)x=5，這說(shuō)明其單條染色體控制著眾多的遺傳信息，增減一條均可能導(dǎo)致配子死亡，故在芍藥屬植物中尚未見(jiàn)有非整倍體的報(bào)道。但在本研究的四倍體×二倍體組合中，對(duì)僅獲得的1株苗進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示為非整倍體(2n=3x+1=16)，可能是四倍體母本產(chǎn)生了有活力的二倍體+1雌配子。