陳黎 黃巖萌 孫夢(mèng)雅 趙滿(mǎn) 吳永祥 萬(wàn)志兵蘇興 趙昌恒

(黃山學(xué)院,黃山,245041)(黃山霧云間生態(tài)農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司)

珠蘭(Chloranthusspicatus)屬金粟蘭科常綠蔓性亞灌木植物。生長(zhǎng)在我國(guó)南方大部分地區(qū)的山坡及茂密的林下，一般為人工栽培，少有野生[1]。珠蘭是一種香花作物，其鮮花香氣持久，與蘭花相似，可鮮用或陰干備用。其容制的珠蘭花茶，品質(zhì)優(yōu)良，清香幽雅，花香持久耐貯藏，是“中國(guó)四大著名茶花”之一[2]。珠蘭在黃山歙縣栽培歷史悠久，也是歙縣三大花茶品類(lèi)之一[3]。珠蘭亦可作園林觀(guān)賞、藥用等[1]。

目前，對(duì)于珠蘭的研究主要集中在繁殖栽培[4-5]、珠蘭花茶制作[6]、珠蘭花成分分析[7-9]等方面，黃衛(wèi)東等[7]以石油醚為溶劑提取新鮮珠蘭花揮發(fā)油，鑒定出60余種組分[7]；龔正禮等[8]采用SDE法萃取珠蘭花茶樣中的揮發(fā)性香氣化合物，鑒定出57個(gè)組分；趙昌恒等[9]用不同干燥方法鑒定了珠蘭花揮發(fā)油的化學(xué)成分，其揮發(fā)油對(duì)4種供試菌均有一定的抑制作用，2種干燥方法所得的揮發(fā)油均有一定的抑菌性、抗氧化能力及酪氨酸酶抑制作用。目前關(guān)于珠蘭葉揮發(fā)油的組成、抗氧化、抑菌活性等研究處于空白，因此，為使珠蘭資源得到充分合理利用，對(duì)珠蘭葉揮發(fā)油化學(xué)組成及生物活性的研究十分必要。本研究以珠蘭鮮葉為材料，利用水蒸氣蒸餾法提取珠蘭葉揮發(fā)油，利用GC-MS鑒定其成分，研究珠蘭鮮葉揮發(fā)油對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2’,-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基的清除能力、抑菌活性及酪氨酸酶抑制作用，為科學(xué)評(píng)估珠蘭葉的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

珠蘭鮮葉于2020年10月采自安徽省黃山市歙縣珠蘭花人工栽培基地。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、變形桿菌(Proteusvulgaris)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、大腸桿菌(Escherichiacoli)購(gòu)于無(wú)錫賽維科技有限公司。

試驗(yàn)使用高壓滅菌器(SQ510C型)；AR124CN型電子天平；SpectraMax-190型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 7890A-5975C型)；超凈工作臺(tái)(ZHJH-C2109B型)；恒溫培養(yǎng)箱(ZGP-2050)。

無(wú)水乙醚、體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇、過(guò)硫酸鉀、甲醇購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DPPH、ABTS、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、槲皮素、左旋多巴、酪氨酸酶購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取

稱(chēng)取磨碎的珠蘭鮮葉50 g置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入500 mL蒸餾水，在揮發(fā)油測(cè)定器中加入一定量的乙醚，用電熱套加熱，保持沸騰狀態(tài)6 h之后停止加熱，將下層的水放出，收集乙醚層。在常溫下?lián)]發(fā)乙醚溶劑，加入無(wú)水硫酸鈉干燥，得到淡黃色透明的芳香油。取適量揮發(fā)油用無(wú)水乙醚稀釋后進(jìn)行GC-MS分析，其余的揮發(fā)油密封后于4 ℃保存，用于抗氧化、酪氨酸酶抑制作用、抑菌活性測(cè)試。

1.2.2 揮發(fā)油化學(xué)成分的GC-MS分析

色譜條件：選用HP-5 MS彈性石英毛細(xì)光柱(0.25 μm，30 m×0.25 mm);載氣為高純氦氣，載氣流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為1.0 μL；進(jìn)樣口溫度為280 ℃，色譜柱初始溫度為60 ℃，保持3 min，以5 ℃·min-1升至280 ℃，保持10 min，運(yùn)行時(shí)間為57 min。

質(zhì)譜條件:離子源溫度230 ℃，電離方式為EI，電子能量為70 eV，四級(jí)桿溫度為150 ℃；質(zhì)量掃描范圍質(zhì)荷比(m/z)為20～400 u；溶劑延遲時(shí)間3 min；通過(guò)GC-MS分析得到總離子流色譜圖，對(duì)匹配度大于80%的組分，選擇NIST08為質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)查找核對(duì)，并查閱文獻(xiàn)對(duì)揮發(fā)油成分進(jìn)行鑒定，采用面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)百分比。

1.2.3 揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照吳永祥等[10]、Cherrat et al.[11]的方法并做適當(dāng)修改，取100 μL質(zhì)量濃度分別為0、3.2、6.4、12.8、25.6 g·L-1的珠蘭葉揮發(fā)油，分別加入50 μL 0.2 mmol·L-1的DPPH-乙醇溶液，充分混合，避光反應(yīng)10 min，于517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品組吸光值(AS1)。樣品對(duì)照組為揮發(fā)油與99.9%乙醇混合測(cè)定的吸光值(AS1B1)，空白組為甲醇與DPPH溶液混合測(cè)定的吸光值(AC1)，空白對(duì)照組為甲醇與99.9%乙醇混合測(cè)定的吸光值(AC1B1)。以槲皮素為陽(yáng)性對(duì)照，3次重復(fù)，取平均值，并按下列公式計(jì)算DPPH自由基清除率:

I=[1-(AS1-AB1/AC1-AC1B1)]×100%。

式中:I為DPPH自由基清除率；AS1為樣品組吸光值；AS1B1為樣品對(duì)照組吸光值；AC1為空白組吸光值；AC1B1為空白對(duì)照組吸光值。

1.2.4 清除ABTS自由基能力的測(cè)定

參照吳永祥等[10]的方法并做適當(dāng)修改，取50 μL質(zhì)量濃度分別為0、3.2、6.4、12.8、25.6 g·L-1的珠蘭葉揮發(fā)油，分別加入100 μL ABTS溶液，充分混合，避光反應(yīng)5 min，于734 nm處測(cè)定樣品組吸光值(AS2)。樣品對(duì)照組為揮發(fā)油與99.9%乙醇混合測(cè)定的吸光值(AS2B2)，空白組為甲醇與ABTS溶液混合測(cè)定的吸光值(AC2)，空白對(duì)照組為甲醇與99.9%的乙醇混合測(cè)定的吸光值(AC2B2)，以槲皮素為陽(yáng)性對(duì)照，3次重復(fù)，取平均值，并按下列公式計(jì)算ABTS自由基清除率:

I=[1-(AS2-AS2B2/AC2-AC2B2)]×100%。

式中:I為ABTS自由基清除率；AS2為樣品組吸光值；AS2B2為樣品對(duì)照組吸光值；AC2為空白組吸光值；AC2B2為空白對(duì)照組吸光值。

1.2.5 揮發(fā)油抑菌活性的測(cè)定

參照翟大才等[12]、王小云等[13]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改，用接種針將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，待菌種活化成功后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的無(wú)菌氯化鈉溶液沖洗長(zhǎng)出的菌落，制備在600 nm處吸光值(OD600)為0.1的菌懸液。吸取100 μL菌懸液滴入無(wú)菌培養(yǎng)基，涂布均勻。分別移取10 μL(質(zhì)量濃度分別為2.57、5.14、7.71 g·L-1)揮發(fā)油滴入直徑為6 mm的無(wú)菌濾紙片中央，以無(wú)菌水為空白對(duì)照(CK)，以對(duì)羥基苯甲酸丙酯為陽(yáng)性對(duì)照，于37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑的大小，3次重復(fù),取平均值。

1.2.6 揮發(fā)油酪氨酸酶抑制作用的測(cè)定

向96孔板中依次加入50 μL緩沖液(pH=6.8)、80 μL 10 mmol·L-1的左旋多巴與50 μL不同質(zhì)量濃度(6.4、12.8、25.6、51.2 g·L-1)的珠蘭葉揮發(fā)油，震蕩后加入20 μL 125菌落·mL-1的酪氨酸酶溶液，混合均勻后在37 ℃恒溫下反應(yīng)15 min，于475 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，并按照下列公式計(jì)算酪氨酸酶抑制率：

I=[1-(AS3-AS3B3/AC3-AC3B3)]×100%。

式中:I為酪氨酸酶抑制率；AS3為樣品組吸光值；AS3B3為樣品對(duì)照組吸光值；AC3為空白組吸光值；AC3B3為空白對(duì)照組吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel和SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，采用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)顯著差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 珠蘭葉揮發(fā)油的化學(xué)成分分析

珠蘭葉揮發(fā)油化學(xué)成分GC-MS分析的總離子流圖見(jiàn)圖1。通過(guò)對(duì)譜庫(kù)NIST08檢索、質(zhì)譜分析確定揮發(fā)油的化學(xué)成分，采用GC峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析。從珠蘭葉揮發(fā)油中共分離出92個(gè)色譜峰，鑒定有55個(gè)化合物匹配度高于80%，占揮發(fā)油總量的82.60%。由表1可以看出，珠蘭葉揮發(fā)油主要成分有烯、醇、酸、烷、酯等，其中烯類(lèi)化合物相對(duì)百分比最多，共有32種，占揮發(fā)油總成分的60.46%；其次是醇類(lèi)化合物，共有10種，占揮發(fā)油總成分的14.52%。相對(duì)百分比大于1.00%的化合物共有20種，主要為烯類(lèi)物質(zhì)、醇類(lèi)物質(zhì)。

圖中色譜峰上數(shù)字與表1化合物序號(hào)相對(duì)應(yīng)

表1 珠蘭葉揮發(fā)油的化學(xué)成分及相對(duì)含量

續(xù)(表1)

2.2 珠蘭葉揮發(fā)油的抗氧化作用

2.2.1 珠蘭葉揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基的清除能力

由表2可知，在各質(zhì)量濃度梯度中，珠蘭葉揮發(fā)油呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，對(duì)DPPH自由基的清除率隨珠蘭葉揮發(fā)油質(zhì)量濃度的升高而增大，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到25.6 g·L-1時(shí)，清除率達(dá)到80.51%。珠蘭葉揮發(fā)油、槲皮素對(duì)DPPH自由基的清除作用的IC50(清除率為50%時(shí)，揮發(fā)油及槲皮素的質(zhì)量濃度)值分別為14.112、0.011 g·L-1，表明珠蘭葉揮發(fā)油的DPPH自由基清除能力弱于槲皮素。

表2 珠蘭葉揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基的清除作用

2.2.2 珠蘭葉揮發(fā)油對(duì)ABTS自由基的清除能力

由表3可知，珠蘭葉揮發(fā)油具有顯著的ABTS自由基清除作用，且呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系。其對(duì)ABTS自由基的清除率隨珠蘭葉揮發(fā)油質(zhì)量濃度的升高而增大，珠蘭揮發(fā)油質(zhì)量濃度越大，清除作用越強(qiáng)，差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，當(dāng)珠蘭葉揮發(fā)油質(zhì)量濃度為25.6 g·L-1時(shí)，清除率達(dá)到90.17%。珠蘭葉揮發(fā)油、槲皮素對(duì)ABTS自由基的清除作用的IC50值分別為3.780、0.009 g·L-1。以上結(jié)果顯示，珠蘭葉揮發(fā)油對(duì)DPPH、ABTS自由基清除作用的變化規(guī)律具有較好的一致性，進(jìn)一步表明了珠蘭葉揮發(fā)油具有一定的抗氧化作用。

表3 珠蘭葉揮發(fā)油對(duì)ABTS自由基的清除作用

2.3 珠蘭葉揮發(fā)油抑制酪氨酸酶的作用

不同質(zhì)量濃度的珠蘭葉揮發(fā)油對(duì)酪氨酸酶抑制作用見(jiàn)表4。隨著珠蘭葉揮發(fā)油質(zhì)量濃度的增加，抑制酪氨酸酶的活性作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)揮發(fā)油質(zhì)量濃度達(dá)到25.6 g·L-1時(shí)，對(duì)酪氨酸酶抑制作用達(dá)到53.72%。珠蘭葉揮發(fā)油、抗壞血酸對(duì)酪氨酸酶的抑制作用的IC50值分別為22.900、0.044 g·L-1。表明珠蘭葉揮發(fā)油的酪氨酸酶抑制作用弱于陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸，這與珠蘭葉揮發(fā)油中的化學(xué)成分種類(lèi)繁多有關(guān)。

表4 珠蘭葉揮發(fā)油對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

2.4 珠蘭葉揮發(fā)油的抑菌作用

從表5可以看出，珠蘭葉揮發(fā)油對(duì)、變形桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有顯著的抑菌效果。當(dāng)揮發(fā)油質(zhì)量濃度為7.71 g·L-1時(shí)，對(duì)綠膿桿菌、變形桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的最大抑菌圈直徑分別為(16.57±0.50)、(12.60±0.26)、(14.40±0.61)、(12.93±1.40)、(15.63±0.32)mm；陽(yáng)性對(duì)照對(duì)羥基苯甲酸丙酯(質(zhì)量濃度為1.00 g·L-1)的最大抑菌圈直徑分別為(18.60±0.72)、(17.63±0.59)、(14.93±0.67)、(17.50±0.98)、(17.10±0.10)mm。表明珠蘭葉揮發(fā)油、對(duì)羥基苯甲酸丙酯對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌均具有一定的抑制作用。當(dāng)揮發(fā)油質(zhì)量濃度為2.57 g·L-1時(shí)，對(duì)5種菌的抑制效果無(wú)差異，隨著質(zhì)量濃度的增大，其對(duì)綠膿桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌抑制效果增強(qiáng)，差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，揮發(fā)油對(duì)這3種菌的抑制效果呈隨質(zhì)量濃度增加而增大，說(shuō)明其對(duì)質(zhì)量濃度效應(yīng)敏感度高。而變形桿菌金、黃色葡萄球菌隨著揮發(fā)油質(zhì)量濃度的增加，抑制效果差異未達(dá)到顯著水平(P<0.05)，說(shuō)明揮發(fā)油對(duì)這2種菌抑制作用存在質(zhì)量濃度飽和效應(yīng)?？傮w來(lái)說(shuō)，當(dāng)揮發(fā)油質(zhì)量濃度較大時(shí)(7.71 g·L-1)，對(duì)5種菌的抑制強(qiáng)弱由大到小依次為綠膿桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌。

表5 珠蘭葉揮發(fā)油對(duì)5種菌的抑菌圈直徑

3 結(jié)論與討論

本研究采用水蒸氣蒸餾法提取珠蘭葉的揮發(fā)油，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)初步鑒定出55種化學(xué)成分，占揮發(fā)油總量的82.60%。珠蘭葉揮發(fā)油化學(xué)成分以烯類(lèi)(60.46%)、醇類(lèi)(14.52%)化合物為主，酯、酸、烷類(lèi)化合物相對(duì)較少。趙昌恒等[9]分析了2種干燥處理后珠蘭花的揮發(fā)油分別為58、56種化合物，其中與珠蘭葉揮發(fā)油中相同化合物有11種，兩者百分比最高的均為烯類(lèi)，分別占47.95%、38.84%。珠蘭葉中烯類(lèi)物質(zhì)占60.46%，但珠蘭花與葉揮發(fā)油化合物種類(lèi)及百分比差異較大，珠蘭花揮發(fā)油以烯、酮、醇這3類(lèi)化合物為主，其中百分比較高的成分有1-(1,4-二甲基-3-環(huán)己烯-1-基)乙酮(11.33%～15.55%)，別香橙烯(6.12%～11.25%)，匙桉醇(5.75%～5.94%)，3-甲氧基苯甲醇(5.08%～11.04%)。研究者在分析其他植物葉片揮發(fā)油的化學(xué)成分中，同樣也發(fā)現(xiàn)烯類(lèi)化合物百分比較高，如楓香葉[14]、海南白沙產(chǎn)裸花紫珠葉[15]、野生天竺桂葉[16]、香青葉[17]、魚(yú)腥草葉[18]的揮發(fā)油中烯類(lèi)化合物百分比分別為90.93%、46.43%、48.75%、71.32%、99.92%，本研究結(jié)果與其研究基本一致，說(shuō)明多數(shù)植物葉揮油成分以烯類(lèi)化合物為主。

珠蘭葉揮發(fā)油含有多種應(yīng)用價(jià)值且百分比較高(>1%)的化學(xué)成分，如桉油烯醇則具有抗炎的作用[19]；d-杜松烯可用作香料[20]；β-桉葉醇具有使體內(nèi)抗自由基氧化能力提升的作用，能夠減緩衰老，同時(shí)也是蒼術(shù)的活性成分之一，還具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗抑郁等中樞神經(jīng)藥理作用[20-22]；α-法尼烯與虎皮病誘導(dǎo)和昆蟲(chóng)誘導(dǎo)有關(guān)[23-24]；α-古蕓烯是黃花敗醬揮發(fā)油的主要成分[25]；α-畢橙茄醇是高效的殺白蟻化合物[26]；α-蒎烯具有鎮(zhèn)咳、祛痛、祛痰和抗真菌作用[27]；(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-十八烷三烯是泡仔姜的最重要的風(fēng)味成分之一[28]，也是白水梔鮮花的香氣主要成分[29]。珠蘭葉揮發(fā)油中百分比較高的二環(huán)大根香葉烯(15.48%)，同樣是楝樹(shù)葉揮發(fā)油主要成分之一(15.43%)[30]，二環(huán)大根香葉烯的功能目前并不明確，但楝樹(shù)葉在藥用、殺蟲(chóng)等方面具有獨(dú)特的效果[30-31]。以上結(jié)果為珠蘭葉的開(kāi)發(fā)利用提供了參考。

珠蘭葉揮發(fā)油對(duì)DPPH、ABTS自由基具有顯著清除能力，對(duì)酪氨酸酶具有一定的抑制作用?？寡趸芰?、酪氨酸酶抑制作用與揮發(fā)油質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系。DPPH、ABTS自由基清除作用的抑制質(zhì)量濃度分別為14.112、3.780 g·L-1。酪氨酸酶抑制作用的抑制質(zhì)量濃度為22.900 g·L-1。本研究表明，在相同質(zhì)量濃度下，珠蘭葉揮發(fā)油對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除能力及對(duì)酪氨酸酶抑制作用弱于槲皮素、抗生素陽(yáng)性對(duì)照，因?yàn)橹樘m葉揮發(fā)油是混合物，其中所含的化學(xué)成分種類(lèi)繁多(92種)，而陽(yáng)性對(duì)照則為分析純，如果進(jìn)一步分離純化珠蘭葉揮發(fā)油中抗氧化活性物質(zhì)，將會(huì)大幅提高其抗氧化和美白效果。

抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，珠蘭葉揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌均具有顯著的抑菌效果，其中在一定范圍內(nèi)珠蘭葉揮發(fā)油對(duì)綠膿桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑制效果隨質(zhì)量濃度增高而增強(qiáng)，而對(duì)變形桿菌金、黃色葡萄球菌抑制作用存在濃度飽和效應(yīng)。珠蘭葉揮發(fā)油具有較好的抗氧化作用、酪氨酸酶抑制作用，這與抑菌活性與烯類(lèi)、醇類(lèi)化合物及成分間的相互作用有關(guān)，但具體是哪種或哪些化合物所起的作用尚未可知，需要進(jìn)一步的研究，以篩選出更有效的活性成分。

綜上所述，珠蘭葉揮發(fā)油具有良好的抗氧化作用、酪氨酸酶抑制作用、抑菌活性，高百分比的烯類(lèi)、醇類(lèi)等活性物質(zhì)是其作用的內(nèi)因。本研究結(jié)果表明，珠蘭葉揮發(fā)油具有一定的藥用價(jià)值及作為殺蟲(chóng)劑、香料、美白的潛能。