宋金雨 張寒冰 張彥妮 岳樺

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

鮮黃連(PlagiorhegmadubiaMaxim.)是小檗科鮮黃連屬多年生草本植物，植株高10～30 cm，單葉，葉片輪廓近圓形，花期4—5月，果期5—6月。鮮黃連屬僅有2種植物，一種是產(chǎn)于東亞的鮮黃連，另一種是產(chǎn)于北美的二葉鮮黃連(Jeffersoniadiphylla)。鮮黃連多生于山坡灌叢中或林下較陰濕的環(huán)境，自然分布于我國東北吉林省、遼寧省，俄羅斯、朝鮮等地[1]。鮮黃連因其獨特的景觀和藥用價值[2-5]，導(dǎo)致根莖被大量采挖，野生資源遭到嚴(yán)重破壞[1]。而有關(guān)鮮黃連的繁育方法，主要有種子繁殖為主的有性繁殖和以植物組織培養(yǎng)、分株繁殖為主的無性繁殖，雖然在2014年王曉煒等對鮮黃連的組培進(jìn)行了一定的研究[1]，但是組培方法存在一定的技術(shù)難度，分株繁殖存在增殖系數(shù)較低、后代退化的問題，所以，種子繁殖是鮮黃連人工育苗工作中最可靠、繁殖效率最高的繁殖方式。然而，鮮黃連種子存在休眠現(xiàn)象，在自然環(huán)境中種子從結(jié)實落地到破土長出第一片真葉，一般需要10～11個月的時間，同時有大量種子在休眠期間喪失了生命力，限制了鮮黃連的人工種植，致使鮮黃連的市場供應(yīng)不足，加劇了資源的匱乏。種子休眠期長、發(fā)芽率低導(dǎo)致鮮黃連資源再生困難，所以，為解決市場對鮮黃連的景觀與藥用的資源需求問題，對于鮮黃連種子快速破眠的研究十分有實際意義。

在鮮黃連屬的種子快速破眠的方面研究較少，僅有2篇文獻(xiàn)報道。1989年Jerry et al.[6]對鮮黃連屬的二葉鮮黃連種子快速破眠進(jìn)行了研究，用質(zhì)量濃度為1 000 mg·L-1的赤霉素溶液浸種后在20 ℃中層積處理，14周后僅有1%～9%種子萌發(fā)。2015年Rhie et al.在韓國對鮮黃連種子進(jìn)行了快速破眠研究[7]。用質(zhì)量濃度為1 000 mg·L-1的赤霉素溶液浸種后在變溫條件下層積3個月，可以使種子萌發(fā)率達(dá)到74.2%，但是在預(yù)實驗中嘗試用此方法處理鮮黃連種子，層積5個月仍不能使鮮黃連種子萌發(fā)，與其研究結(jié)果存在較大差距。由于采用上述方法未能獲得種苗，為解決鮮黃連資源需求問題，為了研究探討鮮黃連種子休眠與萌發(fā)特性，因此，對鮮黃連種子進(jìn)行解剖形態(tài)觀察、萌發(fā)抑制物質(zhì)提取、赤霉素浸種沙藏等試驗，探索研究鮮黃連種子休眠的原因、類型、種子是否含有萌發(fā)抑制物質(zhì)，種子快速破眠方法等，以期為鮮黃連種子休眠與萌發(fā)研究提供一定理論參考，并為種子栽培繁殖育苗提供理論依據(jù)與實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

試驗種子采摘于黑龍江省森林植物園鮮黃連種植區(qū)，2019年6月5日采收后種子全部放置于4 ℃中儲存。

干種子基本信息測定：利用電子游標(biāo)卡尺，對干種子的長度、粒徑進(jìn)行測量。隨機選取100粒種子在電子天平上稱質(zhì)量測量其百粒質(zhì)量，重復(fù)5次。在體式顯微鏡下觀察吸水前、吸水后與沙藏過程中鮮黃連種子的形態(tài)特征。

種子含水量測定[8]：按照國際種子檢驗規(guī)程，將已稱量種子放入帶蓋樣品盒，置于烘箱內(nèi)(103±2)℃烘18 h后，放入干燥器內(nèi)冷卻，再次稱量樣品，3次重復(fù)，計算處理前后質(zhì)量差值。種子相對含水量=[(烘前試樣質(zhì)量一烘后試樣質(zhì)量)/烘前試樣質(zhì)量]×100%。

種子吸水率測定[8]：取供試鮮黃連種樣100粒，3次重復(fù)，置于蒸餾水中，在恒溫25 ℃下使其吸水，每12 h將種子取出，用濾紙吸干外表后稱質(zhì)量，直至其重量恒質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)，依據(jù)公式:吸水率=[(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/干質(zhì)量]×100%,計算吸水率，制作吸水曲線。

該試驗采用TTC染色法[8]測定鮮黃連種子的生活力。隨機取30粒種子(每組30粒，共3組)，水浸泡24 h，縱向切開種子，再以體積分?jǐn)?shù)0.1% TTC溶液在恒溫箱中30 ℃于黑暗條件下染色24 h后，放在顯微鏡下觀察胚及胚乳著色情況。

種子萌發(fā)抑制物質(zhì)生物學(xué)測定：參考常暉[9]等人的方法，以臺灣456白菜種子作為生物測定種子，蒸餾水和80%乙醇為浸提液。稱取磨碎種子1 g共6份，分別置于100 mL的三角瓶中，3瓶加入10 mL蒸餾水，3瓶加入10 mL的體積分?jǐn)?shù)80%乙醇，分別在水浴中25、35、45 ℃浸提2 d。浸提液收集到離心管內(nèi)5 000 r/min離心10 min，過濾，56 ℃條件下濃縮至一定體積后(醇提液蒸干溶劑)，用蒸餾水定容至10 mL，得浸提液質(zhì)量濃度為0.10 g/mL，4 ℃條件下保存。以蒸餾水為對照。在直徑90 mm的培養(yǎng)皿內(nèi)放入2層濾紙，分別加入各浸提液4 mL，白菜種子每皿60粒，3次重復(fù)，在光照與黑暗各12 h的25 ℃光照培養(yǎng)箱中，24 h統(tǒng)計發(fā)芽率，48 h測胚根長度。

種子的快速破眠研究。通過預(yù)實驗觀察發(fā)現(xiàn)，鮮黃連種子萌發(fā)一共存在3個階段：1、吸水膨脹階段；2、內(nèi)部物質(zhì)與能量轉(zhuǎn)化階段；3、萌發(fā)生根階段。其中種子在第2階段時的外部形態(tài)以種皮開裂露出內(nèi)種皮為表現(xiàn)特征，在第3階段時的外部形態(tài)以胚根突破內(nèi)種皮為表現(xiàn)特征。

本試驗將種子在無菌水中浸泡24 h，種子吸脹后，用酒精棉去掉種毛與顆粒物，之后將種子分別置于100、300、500、700、900 mg·L-1的赤霉素溶液中浸泡48 h，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%次氯酸鈉溶液消毒，處理15 min后用無菌水反復(fù)沖洗種子，以在清水中浸泡72 h的種子為對照，將所有種子進(jìn)行濕沙層積處理，沙藏處理A組先在20 ℃環(huán)境1個月后轉(zhuǎn)進(jìn)10 ℃環(huán)境，沙藏處理B組一直在恒溫10 ℃環(huán)境，每個處理30個種子，3次重復(fù)。120 d后統(tǒng)計鮮黃連種子的萌發(fā)率、外種皮開裂率、霉?fàn)€率，拍照記錄種子的動態(tài)變化。

萌發(fā)率=(萌發(fā)種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

外種皮開裂率=(外種皮開裂種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)霉率=(發(fā)霉種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

式中：種子萌發(fā)以胚根生長為種子長度的1/2為標(biāo)準(zhǔn)；外種皮開裂以外種皮開裂露出內(nèi)種皮為標(biāo)準(zhǔn)。

試驗數(shù)據(jù)采用EXCEL2018和SPSS20.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子形態(tài)與百粒質(zhì)量

鮮黃連種子長約(4.392 0±0.094 8)mm，種子粒徑約為(1.536 0±0.043 6)mm，百粒質(zhì)量平均為(0.550 2±0.007 0)g。

種子吸水前為深褐色，呈月牙型，有黃白色種毛。縱切后，種胚為白色線形，胚乳近似透明。種子吸水膨脹后，外種皮顏色變?yōu)闇\褐色?？v切種子有明顯的外種皮、內(nèi)種皮、胚根鞘等結(jié)構(gòu)，胚乳變?yōu)榘咨?/p>

2.2 種子含水量與吸水曲線測定分析

經(jīng)測定，鮮黃連干種子的含水量為5.05%。

鮮黃連成熟干種子在前2 h的吸水率呈直線上升的趨勢，在2 h時吸水率為87.84%，在2 h后仍在繼續(xù)吸水，但在24、36、48、60、72 h吸水率均為111.79%，吸水24 h時，種子已達(dá)到吸水飽和。鮮黃連種子去種皮困難，但在吸水24 h時吸水率已經(jīng)達(dá)到飽和吸水率時的78.57%，說明種皮并未對種子吸水造成較大影響。按照卡恩理論，種子吸水率達(dá)到40%就滿足種子萌發(fā)的生理需求[10]，鮮黃連種子吸水2 h后就達(dá)到種子萌發(fā)的生理需求，種子透水性好，種子吸脹后種皮變軟，表明種子活力較大，有充分吸收水分萌發(fā)的可能性，所以種皮的透水性并不是導(dǎo)致萌發(fā)困難的主要原因(見圖1、2)。

1為干種子形態(tài)；2～3為干種子在體視顯微鏡下形態(tài)(3a為種胚，3b為胚乳，3c為種毛)；4～6為吸脹種子在體視顯微鏡下形態(tài)(6a為外種皮，6b為內(nèi)種皮尖部，6c為胚根鞘，6d為內(nèi)種皮)。

圖2 鮮黃連種子吸水曲線圖

2.3 種子生活力測定

經(jīng)測定，鮮黃連種子生活力為95%，但染色深淺程度有差異，說明鮮黃連種子生活力有強弱差異(圖3)。

1為TTC染色處理；2為染色成功種子在體視顯微鏡下形態(tài)；3為染色未成功種子在體視顯微鏡下形態(tài)。

2.4 種子萌發(fā)抑制物質(zhì)生物學(xué)測定分析

根據(jù)白菜種子的發(fā)芽率和幼根長度判斷鮮黃連種子的浸出液對白菜籽萌發(fā)的影響，試驗結(jié)果如表1所示，所有處理的萌發(fā)率與胚根長度均與對照有顯著差異，說明各浸提液均對白菜籽萌發(fā)造成顯著的抑制作用，25和35 ℃的乙醇浸提液與對照組差異最顯著，萌發(fā)率為0。萌發(fā)率除25、35 ℃醇提液之間不存在顯著差異外，其余各處理之間存在顯著差異，在根長方面各處理之間不存在顯著差異。

表1 不同溶液對白菜種子萌發(fā)的影響

2.5 不同質(zhì)量濃度赤霉素溶液浸種后層積對鮮黃連種子的影響

由試驗結(jié)果表2可知，在沙藏總天數(shù)達(dá)到120 d時，處理A或B組中，種子萌發(fā)率隨著赤霉素質(zhì)量濃度的增加呈先升高后降低的特點。在處理A組中，除了900 mg·L-1赤霉素浸種外，其余處理均與對照有顯著性差異；在處理B組中，除了300與500 mg·L-1赤霉素浸種外，其余處理均與對照無顯著性差異。對照組中沒有種子達(dá)到萌發(fā)的第3階段，說明在120 d內(nèi)無赤霉素浸種直接沙藏處理不能起到使種子萌發(fā)生根的作用。種子在赤霉素質(zhì)量濃度100～700 mg·L-1下可以萌發(fā)長出胚根，在500 mg·L-1萌發(fā)率達(dá)到最高，與對照相比差異最顯著，在A、B兩組中的萌發(fā)率分別是31.11%、18.89%，雖然兩處理的萌發(fā)率較為接近，但是萌發(fā)種子的胚根長度存在著明顯差異(圖4)。

1為處理A組赤霉素500 mg·L-1沙藏120 d效果；2為處理B組赤霉素500 mg·L-1沙藏120 d效果；3為外種皮開裂，露出內(nèi)種皮尖部；4為胚根突破內(nèi)種皮；5為沙藏脫殼種子，5a為子葉，5b為真葉葉芽，5c為胚軸，5d為胚根；6為5b真葉葉芽在體視顯微鏡下放大形態(tài)。

表2 處理A、B組對鮮黃連種子的影響

外種皮開裂率隨著赤霉素質(zhì)量濃度的增加呈先升高后降低的特點，在處理A、B兩組中，所有處理組均與對照組有顯著性差異，對照組中沒有種子外種皮開裂，說明在120 d內(nèi)，無赤霉素浸種直接沙藏處理不能使種子達(dá)到萌發(fā)的第2階段。在赤霉素質(zhì)量濃度100～900 mg·L-1下，均有種皮開裂，在500 mg·L-1種皮開裂率達(dá)到最高，A與B組的萌發(fā)率分別是80.00%、42.22%，說明鮮黃連種子在兩組處理中最合適的赤霉素質(zhì)量濃度均為500 mg·L-1。

鮮黃連種子發(fā)霉率呈現(xiàn)先降低再升高的趨勢。處理A組中，只有300、500、700 mg·L-1赤霉素浸種處理與對照組有顯著性差異；處理B組中，除了900 mg·L-1赤霉素浸種外，其余處理均與對照無顯著性差異。A與B組的對照霉?fàn)€率均為其組內(nèi)最高。低質(zhì)量濃度赤霉素對種子萌發(fā)有正向作用，增加了種子活力，一定程度上減少了霉?fàn)€率，在赤霉素溶液為500 mg·L-1時達(dá)到霉?fàn)€率最低，高質(zhì)量濃度的赤霉素可能對種子產(chǎn)生了毒害作用，對種子活力產(chǎn)生了一定的負(fù)面抑制作用，導(dǎo)致霉?fàn)€。

對比A與B組處理，可以發(fā)現(xiàn)，A組的種子在萌發(fā)率、外種皮開裂率、霉?fàn)€率方面，效果優(yōu)于B組。所以，對于鮮黃連種子萌發(fā)效果最好的方法為：赤霉素質(zhì)量濃度為500 mg·L-1浸種后進(jìn)行濕沙層積，先放入20 ℃環(huán)境(30 d)后10 ℃環(huán)境(90 d)，萌發(fā)率31.11%，外種皮開裂率80.00%，霉?fàn)€率14.44%。

鮮黃連種子萌發(fā)一共有3個階段：1、吸水萌動階段2、內(nèi)部物質(zhì)與能量轉(zhuǎn)化階段3、胚根突破種皮階段。種子萌發(fā)是從吸水膨脹開始的，由弱到強的進(jìn)行一系列生理活動[11]，以赤霉素質(zhì)量濃度500 mg·L-1沙藏處理為例，在干種子吸水后，種子有明顯的膨脹，此階段為鮮黃連種子萌發(fā)的第一階段。之后種子進(jìn)入內(nèi)部物質(zhì)與能量轉(zhuǎn)化階段，在赤霉素沙藏過程中，種子發(fā)生的一系列生理生化變化，可概括為大分子貯藏物質(zhì)進(jìn)行降解轉(zhuǎn)化為可溶性的各種可為胚的代謝、生長過程所利用的物質(zhì)。在層積處理初期，伴隨水解過程各種水解酶、過氧化氫酶、過氧化物酶的活性顯著增強，還原糖及其他可溶性糖和氨基酸等大量增加，為種子呼吸代謝提供底物和能量，種子的呼吸與代謝作用增強[12]。在種子外部的形態(tài)變化是種孔處先伸出黑色的內(nèi)種皮尖部結(jié)構(gòu)，然后外種皮從種孔部位逐漸開裂，內(nèi)種皮結(jié)構(gòu)露出更加明顯，即從沙藏開始到明顯出現(xiàn)第二階段外部特征，至少需要沙藏處理60 d。在沙藏時間達(dá)到120 d時，部分種子的胚根已突破內(nèi)種皮，內(nèi)種皮開裂后胚根向外生長，胚根突破內(nèi)種皮向外生長為鮮黃連種子萌發(fā)第三階段特征。胚根生長到達(dá)一定長度后，外種皮容易脫落，露出子葉，兩個子葉的基部處可以在體式顯微鏡下觀察到有鮮黃連真葉形狀的葉芽存在(圖4)。

3 結(jié)論與討論

種子的休眠與萌發(fā)特性是植物在長期適應(yīng)過程中所形成的重要特征之一，了解其休眠類型與萌發(fā)特性，對于鮮黃連的資源保護(hù)與栽培引種極為重要[13]。根據(jù)國際通用的種子休眠分類系統(tǒng)，種子常見的休眠類型一共有5種：物理休眠、生理休眠、形態(tài)休眠、復(fù)合休眠和形態(tài)生理休眠[14],其中形態(tài)生理休眠類型的種子由于未分化或發(fā)育不完全，具有生理休眠與形態(tài)休眠的雙重性，其種胚一般為線型、匙形或球形[15]。在體視顯微鏡下，觀察到鮮黃連種子有線形胚，符合形態(tài)生理休眠種子的形態(tài)特征，所以從解剖形態(tài)上判斷得出，鮮黃連種子屬于形態(tài)生理休眠類型，種子需要適宜的高溫環(huán)境或赤霉素浸種處理中完成胚胎發(fā)育，具有完全發(fā)育的胚胎種子在低溫層積處理才可以萌發(fā)，這與Rhie et al.[7]研究得出了一致結(jié)論。

本實驗通過對研究鮮黃連種子在25、35、45 ℃溫度下的水提液和醇提液對白菜籽萌發(fā)的影響發(fā)現(xiàn)，各處理均對白菜籽萌發(fā)有顯著抑制作用。以蒸餾水為提取媒介，35 ℃水提液的抑制效果最強，以80%乙醇為提取媒介，25和35 ℃的醇提液的抑制效果最強，對應(yīng)的白菜籽萌發(fā)率0，與35 ℃水提液效果存在顯著差異。各處理的浸提液對白菜種子胚根長度均造成了抑制作用，與對照差異顯著，這表明其種子內(nèi)部存在萌發(fā)抑制物質(zhì)，也是造成鮮黃連種子休眠的原因之一。但由于鮮黃連種皮和胚較難剝離，所以無法判斷種皮和種胚是否均含有萌發(fā)抑制物質(zhì)，以及種類和數(shù)量的差異。

種子休眠主要由種皮障礙、胚發(fā)育狀況和內(nèi)源性發(fā)芽抑制物質(zhì)3方面原因引起[16]，鮮黃連種皮雖較難去除，但吸水后種皮變軟，質(zhì)地并不堅硬難以突破，綜上分析認(rèn)為，鮮黃連種子休眠主要是種胚發(fā)育不完全和種子含有萌發(fā)抑制物質(zhì)而引起的形態(tài)生理休眠，這與紫斑牡丹種子[17]、雙核冬青種子[18]、頂冰花種子[19]休眠原因類似。

赤霉素是一種應(yīng)用及研究上常用的植物激素，它能促進(jìn)細(xì)胞延長和分裂，因此對具有休眠特性的種子,生產(chǎn)實踐中通常選用赤霉素作為打破休眠的激素，促進(jìn)種子萌發(fā)[20]。在預(yù)實驗中重復(fù)Rhie et al.[7]的最佳實驗處理方法，用質(zhì)量濃度為1 000 mg·L-1的赤霉素溶液浸種后在15和6 ℃各12 h的變溫條件層積，5個月仍不能使鮮黃連種子萌發(fā)，沒有獲得與其實驗結(jié)果相近的結(jié)果，存在較大差距，造成這種現(xiàn)象的原因可能與實驗時的光照、溫濕度、沙藏所用沙子、層積控溫儀器、取材地點、采種植株年齡、種子成熟度、種子貯藏方式、消毒方法不同等都有關(guān)系，具體是由于哪一個條件的差異導(dǎo)致，還有待進(jìn)一步研究。

Rhie et al.[7]的研究認(rèn)為鮮黃連種子屬于深度簡單形態(tài)生理休眠，其休眠的打破在自然環(huán)境中需要先經(jīng)過夏、秋季溫度暖層積和冬季冷層積，而赤霉素可以代替暖層積促進(jìn)鮮黃連種胚的生長，但不能代替冷層積促使胚根突破種皮[7]。根據(jù)B組實驗結(jié)果，適宜質(zhì)量濃度的赤霉素溶液浸種后，鮮黃連種子可以萌發(fā)，無赤霉素浸種處理的種子不能萌發(fā)，說明種子在10 ℃低溫沙藏前赤霉素處理的必要性，適宜赤霉素溶液浸種，可以促進(jìn)種子完成生理后熟，代替自然條件中的夏季高溫和秋季高溫，這與Rhie et al.[7]的研究結(jié)論相同。但是在實驗A組中，除900 mg·L-1之外，各赤霉素質(zhì)量濃度下的萌發(fā)效果優(yōu)于實驗B組，說明在恒溫層積時，赤霉素浸種并不能完全代替自然條件夏秋季高溫的作用，赤霉素浸種后再進(jìn)行暖、冷層積，可以使種子在人工恒溫環(huán)境下的萌發(fā)效果更佳。

赤霉素質(zhì)量濃度不夠或超過適宜質(zhì)量濃度，即種子感受性低或遭受逆境，都不足以使種子發(fā)芽[21]，隨著赤霉素浸種時的質(zhì)量濃度變化，鮮黃連種子萌發(fā)效果呈現(xiàn)出低質(zhì)量濃度促進(jìn)高質(zhì)量濃度抑制的趨勢，這種與多葉棘豆種子[22]、銅錢樹種子[23]、頂果木種子[24]的相關(guān)研究得出一致結(jié)論。根據(jù)實地觀察發(fā)現(xiàn)，鮮黃連種子在第一年5月末至6月初成熟，第2年4月地上部分才長出種苗，至少需要10個月的時間，本試驗中，用赤霉素質(zhì)量濃度為500 mg·L-1浸種，先暖層積30 d后冷層積90 d共120 d后，鮮黃連種子的萌發(fā)率最高可以達(dá)到31.11%，加上后期入盆栽20 d，整體上相較于自然環(huán)境下種子出苗縮短了近5個月的時間。該結(jié)果可為鮮黃連的人工化種植奠定理論基礎(chǔ)，也為同屬二葉鮮黃連種子萌發(fā)研究提供一定的指導(dǎo)與借鑒。但該方法下種子萌發(fā)率仍然較低，搭配其他激素與赤霉素一起浸種或改變溫度條件，是否會進(jìn)一步提高鮮黃連種子萌發(fā)率，還有待深入研究。

鮮黃連外種皮較難去除，但從鮮黃連種子吸水曲線可以看出，即使是在不去除其外種皮的情況下，種子有較高的吸水速率，說明外種皮并不會影響水分滲透進(jìn)而影響種子活力。經(jīng)過TTC染色，供試鮮黃連種子生活力為95%，但是染色的顏色深淺程度存在差異，說明各種子之間的生活力強弱存在差異。層積實驗中的對照組、赤霉素100 mg·L-1與900 mg·L-1浸種處理組霉?fàn)€率均較高，最高達(dá)66.7%，這說明種子霉?fàn)€可能也與種子自身活力不足有關(guān)。Rhie的快速破眠方法霉?fàn)€率較低，可能其方法為變溫沙藏，更有利于提高種子活性，從而降低了霉?fàn)€率。另外，長時間不發(fā)芽也會導(dǎo)致種子霉?fàn)€[23]，鮮黃連種子萌發(fā)的確需要較長時間的層積處理，這也可能是導(dǎo)致鮮黃連種子霉?fàn)€率增高的原因之一。

對不同發(fā)芽程度的供試種子進(jìn)行移栽實驗，觀察發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)但未脫殼種子均未能長出葉，不能成活，與銅錢樹種子出現(xiàn)相似狀況[23]，所以建議待種子完全脫殼后再進(jìn)行移栽。萌發(fā)脫殼種子入土栽培20～30 d可以長出葉，但可能環(huán)境不適宜種子生長，種苗出現(xiàn)葉柄細(xì)長徒長現(xiàn)象，最終死亡。所以，萌發(fā)種子的栽培方法與環(huán)境條件，還有待于進(jìn)一步的實驗與探索。