張卓睿 崔金麒 趙羚汐 賈淇舒 楊春曉 王琦

(北華大學(xué)，吉林，132013)

姜貴全 彭鈺博

(北華大學(xué)木質(zhì)材料科學(xué)與工程省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北華大學(xué))) (澳大利亞阿德萊德大學(xué))

榿葉唐棣(Amelanchieralnifolia)是薔薇科唐棣屬落葉小喬木或灌木，為北美洲內(nèi)陸的重要經(jīng)濟(jì)林樹(shù)，目前在我國(guó)遼寧、吉林、黑龍江、山西、陜西、寧夏、內(nèi)蒙、新疆、青海等省區(qū)均有引種栽培[1]。榿葉唐棣果實(shí)為小漿果，形似藍(lán)莓，主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也與藍(lán)莓極為相近，花色苷、原花青素、綠原酸等活性成分含量較高[2]。近年來(lái)，隨著對(duì)榿葉唐棣果實(shí)中活性物質(zhì)組成、含量及功能性研究的逐步深入，榿葉唐棣的種植及果實(shí)深加工技術(shù)也得到了迅速發(fā)展[1]?；ㄉ諏儆谒苄缘奶烊簧兀且环N多酚類(lèi)化合物，由花色素和糖以糖苷鍵結(jié)合而成，其基本結(jié)構(gòu)單元是C6-C3-C6骨架構(gòu)成的2-苯基苯并吡喃[3]，具有抗氧化[4-5]、抗突變[6]、抗腫瘤[7-8]、預(yù)防心血管疾病[9]、抗炎癥[10]和保護(hù)視力[11]等功效，已逐漸成為植物學(xué)、藥學(xué)及營(yíng)養(yǎng)學(xué)的研究熱點(diǎn)。榿葉唐棣花色苷粗提物中含有大量的糖類(lèi)、蛋白質(zhì)類(lèi)、脂類(lèi)及色素等雜質(zhì)[3]，嚴(yán)重影響花色苷的純度，若要深入地研究其生物學(xué)活性并開(kāi)發(fā)相關(guān)產(chǎn)品，則必須對(duì)花色苷粗提物進(jìn)行分離和純化。目前，花色苷的純化方法主要用大孔樹(shù)脂層析法、凝膠層析法、C18反相色譜法等[3]。大孔樹(shù)脂是一類(lèi)高分子吸附分離介質(zhì)，具有高穩(wěn)定性、高選擇性、操作簡(jiǎn)單、成本低廉、適于工業(yè)化生產(chǎn)[12-13]等特點(diǎn)，是當(dāng)前純化天然產(chǎn)物最常采用的一種分離技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于花色苷[13]、多糖[14]、多酚[15]等活性成分的分離純化。本文對(duì)榿葉唐棣花色苷粗提物在大孔樹(shù)脂上的吸附—解吸特性進(jìn)行了研究，優(yōu)選出了最佳的分離純化條件，結(jié)合高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)對(duì)純化組分進(jìn)行了鑒定分析，并評(píng)價(jià)了純化物的抗氧化活性和抑菌性，為榿葉唐棣花色苷的深入研究及開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

榿葉唐棣花色苷提取液：稱(chēng)取榿葉唐棣果100 g，破碎后加入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液1 L，在280 W條件下超聲提取30 min，提取液以8 000 r/min離心分離5 min，取上清液，在低于40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，濃縮液按1∶1的體積比加入乙酸乙酯萃取，除去脂溶性物質(zhì)，再在35 ℃條件下旋轉(zhuǎn)減壓濃縮除去乙酸乙酯，濃縮液過(guò)0.45 μm膜后，得到榿葉唐棣花色苷粗提液，冷凍干燥，密封保存。

HP-2MGL型大孔樹(shù)脂購(gòu)于日本三菱公司；XAD7HP型大孔樹(shù)脂購(gòu)于美國(guó)羅門(mén)哈斯公司；AB-8型、X-5型、D101型大孔樹(shù)脂購(gòu)于安徽三星樹(shù)脂科技有限公司；XDA-8型、LSA-10型大孔樹(shù)脂購(gòu)于西安樸天吸附材料有限公司；HB-16型、HB1600型、XAD-1600型大孔樹(shù)脂購(gòu)于上海旻永實(shí)業(yè)有限公司；甲酸、甲醇、乙醇購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，均為色譜純；DPPH自由基購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；維生素C購(gòu)于天津尖峰生物制品有限公司；其他化學(xué)試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌由北華大學(xué)林學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

試驗(yàn)流程：

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖

1.2 榿葉唐棣花色苷的分離純化

大孔樹(shù)脂的預(yù)處理：先將樹(shù)脂用無(wú)水乙醇浸泡24 h，然后用超純水沖洗至無(wú)醇味，再分別用1 mol/L的HCl和NaOH分別浸泡3 h，超純水沖洗至pH中性，最后置于砂芯漏斗中，真空抽干備用[16]。

大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附—解吸試驗(yàn)。

(1)大孔樹(shù)脂的篩選：分別稱(chēng)取預(yù)處理后的AB-8、X-5、D-101、LSA-10、XAD-7HP、XDA-8、XDA-1600、HB-16、HB-1600、HP2MGL共10種型號(hào)大孔樹(shù)脂0.5 g于250 mL具塞錐形瓶中，各加入質(zhì)量濃度為0.125 g/L花色苷溶液20 mL，于25 ℃、100 r/min的恒溫振蕩器中振蕩24 h，抽濾，采用pH示差法[17]測(cè)定濾液中花色苷的質(zhì)量濃度，同時(shí)向吸附平衡的樹(shù)脂中各加入60%乙醇20 mL，于25 ℃、100 r/min的恒溫振蕩器中振蕩24 h，抽濾，pH示差法測(cè)定濾液中花色苷的質(zhì)量濃度。按公式(1)、(2)計(jì)算不同型號(hào)樹(shù)脂的吸附率和解吸率，考察不同樹(shù)脂對(duì)榿葉唐棣花色苷的吸附和解吸情況。

(1)

(2)

式中：A為吸附率(%)；Co為花色苷溶液初始質(zhì)量濃度(g/L)；Ce為樹(shù)脂吸附平衡時(shí)，抽濾液中花色苷質(zhì)量濃度(g/L)；D為解吸率(%)；Cd為解吸液中花色苷質(zhì)量濃度(g/L)；Vd為解吸液體積(mL)；Vi為花色苷溶液體積(mL)。

(2)吸附時(shí)間對(duì)吸附率的影響：精確稱(chēng)取篩選出的2種大孔樹(shù)脂各0.5 g，置于具塞錐形瓶中，各加入20 mL質(zhì)量濃度為0.125 g/L花色苷溶液，于25 ℃、100 r/min的振蕩器中振蕩，每隔1 h吸取2 mL，測(cè)定花色苷的質(zhì)量濃度并計(jì)算吸附率，考察吸附時(shí)間對(duì)樹(shù)脂吸附效果的影響。

(3)上樣質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響：精確稱(chēng)取5份XDA-8型大孔樹(shù)脂各0.5 g，置于具塞錐形瓶中，各加入20 mL質(zhì)量濃度分別為0.050、0.100、0.150、0.200、0.250 g/L的花色苷提取液，于25 ℃、100 r/min的振蕩器中振蕩4 h，抽濾，測(cè)定濾液中花色苷的質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附率，以確定最佳上樣質(zhì)量濃度。

(4)上樣液pH值對(duì)吸附率的影響：精確稱(chēng)取5份XDA-8型大孔樹(shù)脂各0.5 g，置于具塞錐形瓶中，分別加入pH=1～5、質(zhì)量濃度為0.100 g/L花色苷溶液各20 mL，于25 ℃、100 r/min的恒溫振蕩器中振蕩4 h，抽濾，測(cè)定濾液中花色苷的質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附率，以確定最佳上樣pH值。

大孔樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附—解吸試驗(yàn)。

(1)上樣流速的試驗(yàn)分析：稱(chēng)取4份等量的預(yù)處理后的大孔樹(shù)脂分別濕法裝柱，裝柱體積為36 mL，去離子水平衡4柱體積后，按不同流速分別將pH=2、質(zhì)量濃度為0.100 g/L的花色苷溶液通入樹(shù)脂柱，流出液每10 mL收集一管并測(cè)定花色苷質(zhì)量濃度，當(dāng)達(dá)到泄漏點(diǎn)時(shí)停止進(jìn)樣，考察不同上樣流速對(duì)樹(shù)脂吸附效果的影響。

吸附量=(上樣質(zhì)量濃度×上樣體積-流出液質(zhì)量濃度×流出液體積)/樹(shù)脂質(zhì)量。

(3)

(2)洗脫流速的試驗(yàn)分析：稱(chēng)取3份預(yù)處理后的大孔樹(shù)脂分別濕法裝柱，裝柱體積為36 mL，去離子水平衡4柱體積后，均按2柱體積/h的流速向?qū)游鲋型ㄈ雙H=2、質(zhì)量濃度0.100 g/L的花色苷溶液300 mL，然后分別以不同的流速用去離子水沖洗4柱體積，30%、50%、70%、90%乙醇溶液各沖洗4柱體積，分步收集乙醇洗脫部分的流出液，按公式(4)、(5)計(jì)算花色苷的回收率和純度，將各洗脫梯度的回收率累計(jì)加和得到不同洗脫流速下的累計(jì)回收率，綜合分析花色苷的純度、回收率和累計(jì)回收率3項(xiàng)指標(biāo)，確定不同洗脫流速對(duì)花色苷純化的影響。

(4)

(5)

式中：m1為洗脫液中花色苷的總質(zhì)量(mg)；mo為通入樹(shù)脂柱中的花色苷總質(zhì)量(mg)；ms為水洗液中花色苷總質(zhì)量(mg)；C為花色苷質(zhì)量濃度(g/L)；V為花色苷溶液體積(mL)；md為花色苷凍干粉的質(zhì)量(mg)。

1.3 榿葉唐棣花色苷的成分鑒定

采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)純化樣品1進(jìn)行分析鑒定。

UPLC條件：設(shè)備為WATERS UPLC ACQUITY。色譜柱為ACQUITY UPLC BEHC18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫50 ℃；流動(dòng)相為0.2%甲酸水溶液(A)—甲醇(B)，A為80%，B為20%；進(jìn)樣量為20 μL；流速為0.25 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為520 nm。

質(zhì)譜條件：設(shè)備為MICROMASS Quattro Premier XE。電噴霧離子源，質(zhì)譜采用正離子掃描方式，質(zhì)量掃描范圍質(zhì)核比為50～500，毛細(xì)管電壓3.10 kV，離子源溫度110 ℃，干燥氣溫度380 ℃。

1.4 抗氧化能力的測(cè)定

分別檢測(cè)了純化樣品1的還原能力(普魯士藍(lán)法[18])，DPPH自由基清除能力(比色法[19])和·OH自由基清除能力(鄰二氮菲-Fe2+法[20])。

1.5 抑菌能力的測(cè)定

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌為供試菌株，將活化后的菌株配制成體積為105～106CFU/mL的菌懸液[21]，采用濾紙片法[22]測(cè)定質(zhì)量濃度為1.000、0.500、0.250、0.125 g/L的純化樣品1水溶液對(duì)各菌株的抑菌圈大小，采用二倍稀釋法[23]測(cè)定純化樣品1對(duì)各菌株的最低抑菌濃度(MIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 榿葉唐棣花色苷的分離純化

2.1.1 大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附—解吸試驗(yàn)

大孔樹(shù)脂的篩選結(jié)果。相同試驗(yàn)條件下，10種樹(shù)脂對(duì)榿葉唐棣花色苷的吸附、解吸效果見(jiàn)表1所示。

表1 不同大孔樹(shù)脂對(duì)花色苷的吸附率和解吸率

大孔樹(shù)脂的極性是影響其吸附性的重要因素，如果樹(shù)脂與化合物的極性越接近，二者間所產(chǎn)生的范德華力和氫鍵作用越強(qiáng)，大孔樹(shù)脂對(duì)待純化物的選擇性吸附性能越強(qiáng)，分離效果越好，但若化合物與樹(shù)脂形成死吸附，又會(huì)很難被洗脫下來(lái)，因此，分別選擇了極性HB-16、XDA-8，中等極性XDA-1600、HB-1600、HP2MGL，弱極性AB-8、XAD-7HP、LSA-10和非極性X-5、D-101共10種大孔樹(shù)脂，同時(shí)考察各樹(shù)脂對(duì)樣品的吸附與解吸情況。由表1可以看出，不同類(lèi)型的樹(shù)脂對(duì)花色苷的吸附程度不同，吸附率最高的是XDA-8型樹(shù)脂，為(85.2±1.63)%，其次是樹(shù)脂HB-16，為(82.1±1.75)%；而從各種樹(shù)脂的解吸情況來(lái)看，樹(shù)脂XDA-7HP和HP2MGL解吸效果最好，解吸率分別為(81.3±2.16)%和(78.3±1.29)%，但兩種樹(shù)脂對(duì)榿葉唐棣花色苷的吸附能力較差，無(wú)法達(dá)到理想的分離效果，而HB-16型樹(shù)脂的解吸率僅次于二者，為(77.7±1.57)%，XDA-8再次之，解吸率為(75.8±1.66)%。綜合考慮，篩選出XDA-8型和HB-16型兩種大孔樹(shù)脂進(jìn)行吸附時(shí)間的試驗(yàn)分析。

吸附時(shí)間對(duì)吸附率的影響。時(shí)間對(duì)兩種大孔樹(shù)脂吸附效果的影響見(jiàn)表2所示。從表2可以看出，XDA-8型大孔樹(shù)脂對(duì)榿葉唐棣花色苷的吸附飽和速率相對(duì)較快，在吸附4 h后基本達(dá)到平衡，吸附率為(84.7±1.92)%，之后再延長(zhǎng)時(shí)間，吸附率基本保持不變，分析其原因，可能是由于XDA-8型大孔樹(shù)脂具有高比表面活性，且所含的酯基基團(tuán)與榿葉唐棣花色苷中的酚羥基極易形成氫健，因而表現(xiàn)出較好的吸附性能；而HB-16型大孔樹(shù)脂隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸附率逐漸增大，吸附8 h后仍有繼續(xù)增加的趨勢(shì)，吸附平衡耗時(shí)較長(zhǎng)，分離純化效率低，不適合于生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用。因此，優(yōu)選出XDA-8型大孔樹(shù)脂作為分離純化榿葉唐棣花色苷的最佳樹(shù)脂。

表2 吸附時(shí)間對(duì)樹(shù)脂吸附效果的影響

上樣質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響。XDA-8型大孔樹(shù)脂對(duì)榿葉唐棣花色苷的吸附效果還受樣品質(zhì)量濃度的影響。在花色苷質(zhì)量濃度0.05～0.25 g/L內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，其在XDA-8型大孔樹(shù)脂上的吸附率先增大后減小。當(dāng)榿葉唐棣花色苷質(zhì)量濃度為0.100 g/L時(shí)，XDA-8型大孔樹(shù)脂吸附率達(dá)到最大值，為(85.9±2.01)%，之后再繼續(xù)增加樣品濃度，樹(shù)脂吸附率不升反降，這是由于上樣質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，達(dá)到吸附飽和的樹(shù)脂無(wú)法繼續(xù)吸附樣液中過(guò)量的花色苷，致使吸附率迅速下降，而且樣品質(zhì)量濃度越高，所含雜質(zhì)也越多，容易堵塞樹(shù)脂孔徑，導(dǎo)致吸附效果不佳。因此，確定適宜的上樣質(zhì)量濃度為0.100 g/L。

上樣pH值對(duì)吸附率的影響。pH值的變化會(huì)導(dǎo)致花色苷的溶解性和極性發(fā)生改變，而在酸性環(huán)境中，花色苷中的酚羥基電離減少，使其多以分子形式存在，穩(wěn)定性好[24]，更有利于XDA-8型大孔樹(shù)脂對(duì)其吸附。通過(guò)試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，在pH=1～5內(nèi)，隨著pH值的增加，榿葉唐棣花色苷在XDA-8型大孔樹(shù)脂上的吸附率先增加后減小。當(dāng)花色苷溶液pH=2.0時(shí)，吸附率最高，為(87.3±2.11)%。因此，確定適宜的上樣pH值為2.0。

2.1.2 大孔樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附—解吸試驗(yàn)

上樣流速的試驗(yàn)結(jié)果。樹(shù)脂純化過(guò)程中，當(dāng)流出液質(zhì)量濃度為上樣液質(zhì)量濃度10%左右時(shí)，認(rèn)為樹(shù)脂的吸附量已達(dá)到飽和，此時(shí)稱(chēng)為泄露點(diǎn)。從表3可以看出，上樣流速1柱體積/h的泄露點(diǎn)出現(xiàn)最晚，當(dāng)流出液體積為(370±2.1)mL時(shí)樹(shù)脂吸附達(dá)到飽和，吸附量為(26.24±0.39)mg/g，雖然吸附效果是所有試驗(yàn)組中最好的，但上柱用了(612±3.5)min，耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，是2柱體積/h的2.7倍，吸附量卻僅比2柱體積/h多20.88%，而吸附時(shí)間越長(zhǎng)越易出現(xiàn)死吸附現(xiàn)象，影響后面大孔樹(shù)脂的洗脫[25]；上樣流速2柱體積/h的吸附量?jī)H次于1柱體積/h，為(20.76±0.27)mg/g，上柱時(shí)間(225±1.3)min<4 h，是3柱體積/h的1.8倍，但吸附量比3柱體積/h高出51.11%；上樣流速3柱體積/h和4柱體積/h的漏點(diǎn)出現(xiàn)較早，但吸附量皆較低，分別為10.15±0.44、8.39±0.34，可見(jiàn)過(guò)快的上樣速度會(huì)使花色苷未被充分吸附就流出了層析柱，達(dá)不到較好的吸附分離效果。綜合考慮純化效率和樹(shù)脂吸附飽和等方面的因素，選擇適宜的上樣流速為2柱體積/h。

表3 不同上樣流速對(duì)樹(shù)脂吸附效果的影響

洗脫流速的試驗(yàn)結(jié)果。由表4可知，在流速4柱體積/h條件下，70%乙醇洗脫梯度所得花色苷純度最高，為40.48%，但該梯度花色苷回收率較低，僅為8.12%，無(wú)實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，所以不能作為最佳洗脫條件；而流速3柱體積/h、50%乙醇洗脫梯度所得的花色苷純度是39.55%，回收率為40.13%，花色苷的純度和回收率都較好，且該洗脫流速的花色苷累計(jì)回收率為91.16%，是所有流速中最高的。因此，本實(shí)驗(yàn)選用3柱體積/h的流速作為最佳洗脫流速。

表4 不同洗脫流速的影響

2.1.3 榿葉唐棣花色苷純化物的制備

將預(yù)處理后的XDA-8型大孔樹(shù)脂濕法裝柱，去離子水平衡4柱體積后，將pH=2、質(zhì)量濃度為0.100 g/L的花色苷溶液按2柱體積/h的流速通入大孔樹(shù)脂柱，待流出液達(dá)到泄露點(diǎn)時(shí)停止進(jìn)樣，以3柱體積/h的流速用去離子水沖洗4柱體積，30%、50%、70%、90%乙醇溶液各沖洗4柱體積，分步收集各梯度的洗脫液，將50%乙醇洗脫部分在低于40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，濃縮液冷凍干燥24 h，制得純化樣品1。

2.2 超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)果

純化樣品1在520 nm處的液相色譜圖如圖2所示。在520 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，純化樣品1主要含有3種組分，出峰時(shí)間集中在8～16 min內(nèi)，其中保留時(shí)間在8.92和15.82 min為純化樣品1的兩種主要組分，保留時(shí)間在11.12 min的組分含量相對(duì)較少。3種組分的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3所示。

圖2 純化樣品在520 nm處的色譜圖

由圖3可知，保留時(shí)間8.92 min組分的質(zhì)譜圖中，檢測(cè)到了矢車(chē)菊色素的特征離子質(zhì)核比287[26]，且其母離子質(zhì)核比449.4與子離子質(zhì)核比287相差162，是失去1分子葡萄糖苷的相對(duì)分子量，由此初步推斷此化合物為矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷[27]；保留時(shí)間11.12 min組分的母離子質(zhì)核比465.4，在能量碰撞下失去1分子葡萄糖苷得到子離子質(zhì)核比303.2[M-162]+，而質(zhì)核比303.2為飛燕草素的特征離子，依此初步推斷此化合物為飛燕草素-3-葡萄糖苷[28]；保留時(shí)間15.82 min組分的子離子質(zhì)核比331.3是錦葵素的特征離子，與母離子質(zhì)核比493.4相差162，說(shuō)明母離子在能量碰撞下脫去了1分子葡萄糖苷，因此初步推測(cè)此化合物為錦葵素-3-葡萄糖苷[26]。

2.3 榿葉唐棣花色苷的抗氧化活性

2.3.1 還原能力

由表5可知，在測(cè)定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(5～15 mg/L)，純化后的榿葉唐棣花色苷還原能力遠(yuǎn)高于同質(zhì)量濃度下的維生素C，且還原能力與質(zhì)量濃度呈明顯的量效關(guān)系，即隨著質(zhì)量濃度的增大，還原能力也隨著增強(qiáng)。分析原因可能是因?yàn)闃伻~唐棣花色苷純化樣品中矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，而矢車(chē)菊素B環(huán)含有2個(gè)羥基，故具有較強(qiáng)的抗氧化活性[29]。

表5 純化樣品的還原能力

2.3.2 DPPH·的清除能力

由表6可以看出，在測(cè)定質(zhì)量濃度5～100 mg/L范圍內(nèi)，花色苷清除DPPH·的能力要遠(yuǎn)高于同質(zhì)量濃度的維生素C。當(dāng)花色苷質(zhì)量濃度小于25 mg/L時(shí)，隨著花色苷濃度的增加，DPPH·清除率隨之急劇增大；當(dāng)花色苷質(zhì)量濃度大于25 mg/L時(shí)，DPPH·清除率仍隨花色苷質(zhì)量濃度的增加而增大，但增加趨勢(shì)趨于緩，當(dāng)質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)，DPPH·清除率可達(dá)到(97.4±2.04)%。

2.3.3 ·OH的清除能力

在氧自由基中，·OH最為活潑，能夠迅速破壞生物體細(xì)胞內(nèi)的DNA等物質(zhì)，因此危害極大。由表7可以看出，榿葉唐棣花色苷具有較強(qiáng)的清除·OH能力，·OH清除率要高于同質(zhì)量濃度的Vc，在測(cè)定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(5～50 mg/L)，隨花色苷質(zhì)量濃度增加，其清除·OH能力逐漸增大，在花色苷質(zhì)量濃度為50 mg/L時(shí)，·OH清除率可達(dá)到(95.6±1.74)%。

2.4 榿葉唐棣花色苷的抑菌活性

2.4.1 榿葉唐棣花色苷的抑菌圈

純化后的榿葉唐棣花色苷的抑菌活性見(jiàn)表8所示。

表8 榿葉唐棣花色苷對(duì)3種供試菌的抑菌圈大小

從表8可以看出，純化后的榿葉唐棣花色苷對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用，由抑菌圈直徑大小可分析出其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制能力最強(qiáng)，大腸桿菌次之，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制能力相對(duì)較弱。在測(cè)定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(0.125～1.000 g/L)，抑菌效果隨著花色苷質(zhì)量濃度的增加而增大，當(dāng)花色苷質(zhì)量濃度為1 g/L時(shí)，對(duì)3種供試菌株的抑菌圈直徑均達(dá)到最大值，其中對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為(15.2±0.15)mm，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為(14.9±0.12)mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為(16.7±0.19)mm。

2.4.2 榿葉唐棣花色苷的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)

從表9可以看出，純化后的榿葉唐棣花色苷對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.125 g/L，對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.250 g/L，對(duì)枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度為0.500 g/L。雖然針對(duì)不同的菌種，榿葉唐棣花色苷純化物的抑制效果略有不同，但均可起到抑制作用，大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，枯草芽孢桿菌與金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，說(shuō)明榿葉唐棣花色苷對(duì)細(xì)菌具有一定的抑制作用。

表9 榿葉唐棣花色苷對(duì)3種供試菌的最低抑菌質(zhì)量濃度

3 結(jié)論

利用XDA-8型大孔樹(shù)脂分離純化了榿葉唐棣花色苷，確定最佳的純化工藝條件為：將pH=2、質(zhì)量濃度為0.100 g/L的花色苷溶液按2柱體積/h的流速通入XDA-8型大孔樹(shù)脂柱，待樹(shù)脂吸附飽和后，先通入去離子水沖洗4柱體積，然后按3柱體積/h的流速分別用30%、50%、70%、90%乙醇溶液各沖洗4柱體積，分步收集各梯度的洗脫液。其中50%乙醇洗脫部分的花色苷純度可達(dá)到39.55%，經(jīng)分析檢測(cè)，鑒定出其主要成分為矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷和錦葵素-3-葡萄糖苷。通過(guò)抗氧化試驗(yàn)，確定榿葉唐棣花色苷純化物具有較好的抗氧化性，其還原能力、清除DPPH自由基和OH自由基能力均優(yōu)于同質(zhì)量濃度的維生素C。而經(jīng)過(guò)抑菌性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)榿葉唐棣花色苷對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌皆可起到一定的抑菌效果。本研究結(jié)果能為榿葉唐棣花色苷的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)，具有一定的研究?jī)r(jià)值及意義。今后可以利用更精細(xì)的分離手段對(duì)榿葉唐棣花色苷組分進(jìn)行精制，結(jié)合UPLC-MS和NMR等檢測(cè)手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，開(kāi)展更深入的研究。