張茂星，陳 鵬，張明超，阮云澤，李 榮，朱毅勇*，沈其榮

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)院，江蘇南京210095;2海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南?？?71101)

香蕉枯萎病又名香蕉巴拿馬病、黃葉病，是一種真菌引起的土傳病害［1］。其病原菌是尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusarium oxysporum f.sp.Cubense)，有4個(gè)生理小種。自1967年在臺(tái)灣首次發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎?。?］之后，廣東［3-4］、福建［5］、海南［6］等地也相繼發(fā)生，侵染小種為1號(hào)和4號(hào)。4號(hào)小種主要侵染香牙蕉(AAA)，而我國(guó)種植的品種巴西蕉、巴貝多、威廉姆斯，都屬于香牙蕉類，極易感染，因此國(guó)內(nèi)大多數(shù)香蕉種植產(chǎn)業(yè)因此而遭受重創(chuàng)。由于該病原菌可通過(guò)帶病吸芽、土壤、雨水和氣流等進(jìn)行傳播，因此蔓延迅速，而且病原菌在土壤中可長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)兼性寄生生活，一般的化學(xué)藥劑難以徹底根除。雖然理論上可以通過(guò)培育抗病品種來(lái)避免香蕉枯萎病菌的浸染，但是在實(shí)踐中周期很長(zhǎng)，無(wú)法解決當(dāng)前存在的問(wèn)題［7］。目前也有不少生物防治［8］的方法，但是由于缺乏相應(yīng)的理論基礎(chǔ)，還處于摸索階段。

從植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)的角度發(fā)現(xiàn)，氮素形態(tài)與含量可以影響很多病原菌的生長(zhǎng)。Sabine等［9］研究者在2008年報(bào)道，10 mmol/L的銨態(tài)氮可以抑制水稻惡苗病原菌(Fusarium fujikuroi)透性酶MeaB合成比卡霉素，從而降低其致病性。而Talbot［10］早在1993就發(fā)現(xiàn)，在缺少硝態(tài)氮的條件下能夠影響水稻稻瘟病和小麥赤霉病的病原菌侵染，這也被大量的研究者所證實(shí)［11-14］，研究認(rèn)為在缺少硝態(tài)氮時(shí)，稻瘟病病原菌的致病基因表達(dá)增強(qiáng)。植物病理學(xué)研究表明，香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌在致病過(guò)程中首先要吸附并定植在植物根系表面，之后穿透細(xì)胞壁，最后寄生在植物細(xì)胞中生長(zhǎng)繁殖，并產(chǎn)生一些次級(jí)代謝產(chǎn)物和毒素致使植物維管束堵塞，葉片枯萎，植株死亡［15］。有研究者發(fā)現(xiàn)，在番茄感染相應(yīng)的尖孢鐮刀菌時(shí)，病原菌的菌絲體在穿透植物細(xì)胞壁的過(guò)程中受到基因的參與，而銨態(tài)氮可以抑制該基因的表達(dá)，從而影響其侵染。因此，如何從植物營(yíng)養(yǎng)的角度來(lái)研究并闡明氮素對(duì)病原菌生長(zhǎng)與侵染的影響，并在實(shí)際生產(chǎn)中調(diào)控土壤中的氮素形態(tài)，含量的變化，對(duì)于調(diào)控枯萎病的發(fā)生具有重要的理論與實(shí)踐指導(dǎo)意義。

而有關(guān)香蕉枯萎病是否受到氮素形態(tài)的影響，及病原菌對(duì)氮素的響應(yīng)機(jī)制，到目前為止還未見(jiàn)報(bào)道。因此在本研究中，我們利用不同硝銨配比對(duì)海南香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)的影響進(jìn)行了研究，并利用生物膜研究了其菌絲體在不同氮素處理下的穿透能力，為實(shí)踐中如何通過(guò)調(diào)控氮素營(yíng)養(yǎng)，控制枯萎病提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉枯萎病病原菌是由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化利用高新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行篩選，屬于尖孢鐮刀菌古巴?；?，并經(jīng)過(guò)分子鑒定為香蕉枯萎病4號(hào)生理小種。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)按照霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液的配方，并加一定量的葡萄糖(見(jiàn)表1)，加入瓊脂(20g/L)后配成固體培養(yǎng)基，其中的氮源設(shè)置7個(gè)處理:對(duì)照，不加氮源(N0+A0);100% 硝態(tài)氮(N100%);75%硝態(tài)氮+25%銨態(tài)氮(N75%+A25%);50%硝態(tài)氮+50%銨態(tài)氮(N50%+A50%);25%硝態(tài)氮+75%銨態(tài)氮(N25%+A75%);100%銨態(tài)氮(A100%)，PDA(potato dextrose agar)。pH 用 tris-HCl調(diào)節(jié)至4或6。分別配置500 mL培養(yǎng)基后分裝100 mL到250 mL三角瓶，高溫高壓蒸汽滅菌30 min。培養(yǎng)基成分按照表1的標(biāo)準(zhǔn)，其中氮源是在培養(yǎng)基滅菌后添加，總氮是10 mmol/L。硝酸鈉和氯化銨溶液分別用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后加入培養(yǎng)基并倒入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中用直徑為5mm的打孔器接種香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌菌塊1塊。每個(gè)處理重復(fù)3次，在28℃恒溫培養(yǎng)箱下培養(yǎng)5 d后測(cè)菌落直徑。

表1 培養(yǎng)基各組分濃度及硝銨配比Table 1 The concentrations of culture medium components and nitrate/ammonium ratios

在不同濃度銨對(duì)尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)的影響的試驗(yàn)中，培養(yǎng)基成分除氮源為不同濃度的氯化銨外，其余各組分如上。試驗(yàn)設(shè)8個(gè)處理，銨態(tài)氮濃度分別為0、1、2、5、10、15、20、25 mmol/L。

模擬細(xì)胞壁穿透試驗(yàn)的處理方法同上，將總的氮源設(shè)為 5和 10 mmol/L，并將滅菌的賽璐膜(cellophane membrane 孔徑 0.22 μm，直徑為 50 mm)先覆蓋在培養(yǎng)基表面并接種一塊直徑為5 mm的香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌。培養(yǎng)4 d后在無(wú)菌環(huán)境下將膜取出，第5 d觀察菌落生長(zhǎng)情況［16］。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2003和SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和顯著性水平檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硝/銨配比和pH對(duì)香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)的影響

從圖1可以看出，尖孢鐮刀菌在PDA培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)不受pH影響。然而在不同硝銨配比處理中，低pH(pH=4)時(shí)均導(dǎo)致尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)受到抑制。在同一pH值條件下，100%銨處理(A100%)中尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)與其它硝銨配比處理差異顯著，菌落直徑均小于4 cm。但是在有硝態(tài)氮存在的情況下，尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)甚至比PDA處理的生長(zhǎng)更好，且差異顯著。雖然在不加氮源的處理中，尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)就其菌落直徑而言，與PDA處理差異不顯著，但是菌絲體顏色很淺，菌絲量很少，說(shuō)明其生長(zhǎng)量可能受到氮源不足的影響。

圖1 不同硝銨配比和pH對(duì)尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)的影響Fig．1 The effects of different ammonium/nitrate ratios and pH on FOC4 growth

2.2 不同銨態(tài)氮濃度對(duì)香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)的影響

通過(guò)室內(nèi)恒溫培養(yǎng)5 d后(圖2)尖孢鐮刀菌的菌落直徑基本上都在小于等于5 cm的范圍。總體上，尖孢鐮刀菌在全銨培養(yǎng)基上受不同pH的影響較小，差異不明顯。從圖2-III中可以看出，尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)在第4 d開(kāi)始受到抑制，并且在同一pH條件下，銨態(tài)氮濃度大于等于5 mmol/L時(shí)，尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)受到顯著的抑制，菌落直徑都小于4 cm。其中在pH為4時(shí)，銨態(tài)氮濃度為20 mmol/L與25mmol/L的處理差異不顯著，這說(shuō)明，當(dāng)銨濃度達(dá)到20mmol/L以上時(shí)就產(chǎn)生了明顯的抑制效果。

圖2 不同濃度的銨對(duì)香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)的影響Fig．2 The effects of different ammonium concentrations on FOC4 growth

2.3 不同濃度的硝/銨配比對(duì)尖孢鐮刀菌侵染膜的影響

從圖3和圖4可以看出，通過(guò)室內(nèi)恒溫培養(yǎng)，尖孢鐮刀菌在不同硝銨配比的情況下侵染賽璐玢(cellophane)存在一定的差異。尖孢鐮刀菌在N100%，N75%+A25%，N50%+A50%，N25%+A75%，PDA處理的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d后揭膜，1d后都長(zhǎng)有一定量的菌絲。然而在N0%+A0%和A100%的固體培養(yǎng)基中揭膜1d后都沒(méi)有長(zhǎng)菌絲。從而可以得出尖孢鐮刀菌在侵染膜的過(guò)程中需要氮源，然而銨態(tài)氮可以阻止其侵染穿透。我們還通過(guò)不同濃度的氮源試驗(yàn)，各硝/銨配比的處理都得出了同樣的結(jié)果。

3 討論與結(jié)論

微生物的氮源譜十分廣泛，一般可分為有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮兩大類，其中無(wú)機(jī)氮主要是硝態(tài)氮和銨態(tài)氮。Schneper［17］等指出真菌可以根據(jù)其周圍環(huán)境中不同種類和數(shù)量的氮源，自動(dòng)調(diào)節(jié)達(dá)到氮源利用的最大化而獲得生存。秦涵淳［18］等發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分中氮對(duì)香蕉尖孢鐮刀菌的影響比碳的大。在一定C/N比條件下，有機(jī)氮含量越高，菌絲生長(zhǎng)越快也越多。但是有關(guān)無(wú)機(jī)態(tài)氮對(duì)真菌生長(zhǎng)的影響還不清楚。

在實(shí)際生產(chǎn)中，有研究者［19］通過(guò)改性石灰氮防治香蕉枯萎病取得一定效果，石灰氮在土壤中分解產(chǎn)生了氰胺類化合物對(duì)香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌起到觸殺的效果。我們通過(guò)室內(nèi)模擬土壤消毒試驗(yàn)和大田消毒實(shí)驗(yàn)(未發(fā)表)發(fā)現(xiàn)，一定量的氨水或者碳銨與石灰混合消毒，也可以預(yù)防和抑制尖孢鐮刀菌的傳播。這些結(jié)果都說(shuō)明，一定濃度的銨態(tài)氮可能是抑制香蕉枯萎病生長(zhǎng)的一個(gè)重要原因。另外，國(guó)外的研究者［20］等通過(guò)木霉T34在不同硝/銨配比情況下對(duì)番茄枯萎病的防控作用中發(fā)現(xiàn)，增加銨的濃度可以減少番茄枯萎病的病情指數(shù)。在本次試驗(yàn)中，尖孢鐮刀菌在全銨的固體培養(yǎng)基中其生長(zhǎng)受到了抑制(圖1)，這與上述研究結(jié)果一致。

圖3 不同濃度的硝/銨配比對(duì)尖孢鐮刀菌侵染膜的影響(氮濃度為5mmol/L)Fig．3 Effects of different ammonium/nitrate ratios on the cellophane penetration of FOC4(The nitrogen concentration was 5 mmol/L)

由于植物細(xì)胞在吸收銨態(tài)氮時(shí)，會(huì)同時(shí)造成質(zhì)外體及周圍環(huán)境酸化。其原因主要是與NH+4的吸收方式有關(guān)，即NH+4與H+的反向運(yùn)輸或NH+4脫質(zhì)子化后以 NH3的形式進(jìn)入細(xì)胞［21-22］。因此，銨態(tài)氮抑制香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)究竟是其本身的抑制作用還是由于酸化造成的還不明確。從圖1可以看出，尖孢鐮刀菌在低pH條件下生長(zhǎng)受到抑制。林妃［23］等的研究認(rèn)為尖孢鐮刀菌在pH為6或7時(shí)生長(zhǎng)最快，低于5或大于8時(shí)，則生長(zhǎng)均受到一定的抑制，并且其產(chǎn)孢量也減少。這說(shuō)明，銨態(tài)氮源抑制香蕉尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)(圖1)，其中一部分原因也可能是由于銨態(tài)氮吸收后周圍環(huán)境中的pH降低導(dǎo)致的。圖2的結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，當(dāng)銨態(tài)氮濃度升高后，銨態(tài)氮本身對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制起主導(dǎo)作用，超過(guò)了低pH對(duì)尖孢鐮刀菌的影響作用。

圖4 不同濃度的硝/銨配比對(duì)尖孢鐮刀菌侵染膜的影響(氮濃度為10 mmol/L)Fig．4 Effects of different ammonium/nitrate ratios on the cellophane penetration of FOC4(The nitrogen concentration was 10 mmol/L)

此外，Snoeijers［24］等在 2000 年就指出，氮源本身也是一些真菌侵染植物寄主細(xì)胞時(shí)的信號(hào)分子，氮代謝會(huì)激活致病基因的表達(dá)。Di Pietro［25］等在2001年證明了蛋白激酶Fmk1是尖孢鐮刀菌侵染番茄寄主細(xì)胞時(shí)必不可少的，其表達(dá)直接影響到菌絲體穿透細(xì)胞壁。2010年 Di Pietro又發(fā)現(xiàn)［16］，在控制Fmk1基因表達(dá)的上游轉(zhuǎn)錄因子中有一個(gè)bZIP蛋白MeaB受到銨態(tài)氮的影響，并直接抑制了Fmk1的表達(dá)，而另一個(gè)受銨影響的蛋白激酶TOR也可以直接影響尖孢鐮刀菌侵染番茄。他們發(fā)現(xiàn)銨態(tài)氮可以促進(jìn)谷氨酰胺和蛋白激酶TOR的合成，從而引起轉(zhuǎn)錄因子MeaB的表達(dá)，但是MeaB的表達(dá)會(huì)抑制Fmk1基因的表達(dá)，從而影響病原菌穿透細(xì)胞壁。從圖3、圖4中可以看出，隨著銨態(tài)氮比例或是濃度的增加，香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌穿透賽璐玢(cellophane)的菌絲減少，甚至在全銨培養(yǎng)時(shí)肉眼幾乎無(wú)法觀察到，這與Di Pietro在研究番茄枯萎病時(shí)的結(jié)果非常相似［16］。這說(shuō)明，銨態(tài)氮很可能也通過(guò)類似的信號(hào)通路影響了香蕉尖孢鐮刀菌穿透植株細(xì)胞壁的過(guò)程。因此，相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制還需要在香蕉尖孢鐮刀菌中進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，銨氮態(tài)在一定程度可以有效地控制香蕉尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)與侵染過(guò)程，在實(shí)踐中可以通過(guò)相應(yīng)的施肥措施來(lái)調(diào)控香蕉枯萎病的發(fā)生，但是還需要在大田試驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證，這也將是今后研究的一個(gè)方向。

［1］ 顏速亮，林電，常春榮，等.反季節(jié)組培香蕉氮、磷、鉀肥料配比施肥時(shí)期及其效應(yīng)研究［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，2002，23(2):36-39.Yan S L，Lin D，Chang C R et al.The effect and period of N，P，K fertilizer on anti-season cultivation banana［J］.Chin.J.Trop.Crops，2002，23(2):36-39.

［2］ Sun E J，Su H J，Ko W H.Identification of Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4 from soil or host tissue by cultural characters［J］.Phytopathology，1978，68:1672-1673.

［3］ 王璧生，羅啟浩.廣東香蕉的主要病害及其防治［J］.中國(guó)南方果樹(shù)，1997，26(3):33-36.Wang B S，Luo Q H.The main diseases of Guangdong bananas and its control［J］.South China Fruits，1997，26(3):33-36.

［4］ 劉景梅，王璧生，陳霞，等.廣東香蕉枯萎病菌生理小種RAPD技術(shù)的建立［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，(4):43-45.Liu J M，Wang B S，Chen X et al.The RAPD technology established of Guangdong banana wilt disease race［J］.Guangdong Agric.Sci.，2004，(4):43-45.

［5］ 林時(shí)遲，張紹升，周樂(lè)峰，等.福建省香蕉枯萎病鑒定［J］.福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，29(4):465-469.Lin S C，Zhang S S，Zhou L F et al.Identification of banana vascular wilt in Fujian［J］.J.Fujian Agric.Univ.，2004，(4):43-45.

［6］ 周傳波，莊光輝，張世能，等.海南島香蕉兩新病害的調(diào)查及病原菌鑒定［J］.海南農(nóng)業(yè)科技，2003，(3):1-5.Zhou C B，Zhuang G H，Zhang S N et al.Hainan island banana new diseases investigation and two pathogens identified［J］.Hainan Agric.Sci.Technol.，2003，(3):1-5.

［7］ 劉紹欽，梁張慧，黃熾輝，等.抗枯萎病香蕉新品系農(nóng)科1號(hào)的選育［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，1(3):30-33.Liu S Q，Liang Z H，Huang Z M et al.The new strain breeding of NongKe 1 to resistance banana wilt disease［J］.Guangdong Agric.Sci.，2007，1(3):30-33.

［8］ 何欣，郝文雅，沈其榮，等.生物有機(jī)肥對(duì)香蕉植株生長(zhǎng)和香蕉枯萎病防治的研究［J］.植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2010，16(4):978-985.He X，Hao W Y，Shen Q R et al.Effectsvof bioorganic fertilization on growth and controlling fusarium wilt disease of banana［J］.Plant.Nutr.Ferti.Sci.，2010，16(4):978-985.

［9］ Sabine T，Bettina T.Impact of ammonium permeases MepA，MepB，and MepC on nitrogen regulated secondary metabolism in Fusarium fujikuroi［J］.Eukaryottc Cell，2008，7(2):187-201.

［10］ Talbot N J，Hamer J E.Identification and characterization of MPG1，a gene involved in pathogenicity from the rice blast fungus Magnaporthe grisea［J］.Plant Cell，1993，5:1575-1590.

［11］ Coleman M，Arnau J.Starvation induced genes of the tomato pathogen Cladosporium fulvumare also induced during growth in planta［J］.Mol.Plant Microbiol Interact.，1997，10:1106-1109.

［12］ Stephenson S A，Green J R.Cloning and characterisation of glutamine synthetase from colletotrichum gloeosporioides and demonstration of elevated expression during pathogenesis on Stylosanthes guianensis［J］.Curr.Genet.，1997，31:447-454.

［13］ Divon H，Di Pietro A，F(xiàn)luhr R.Nitrogen responsive genes are differentially regulated in planta during Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici infection［J］.Mol.Plant Pathol.，2005，6:459-470.

［14］ Donofrio N M，Dean R A.Global gene expression during nitrogen starvation in the rice blast fungus，Magnaporthe grisea［J］.Fungal.Genet.Biol.，2006，43:605-617.

［15］ 黎永堅(jiān)，于莉.香蕉枯萎病發(fā)病機(jī)制及其防治技術(shù)研究［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22(8):515-519.Li Y J，Yu L.The study on the pathogenesis and control of banana vascular wilt［J］.Chin.Agric.Sci.Bull.，2006，22(8):515-519.

［16］ Di Pietro A，Manuel S A.Nitrogen response pathway regulates virulence functions in Fusarium oxysporum via the protein kinase TOR and the bZIP Protein MeaB［J］.Plant Cell，2010，22:2459-2475.

［17］ Schneper L，Duvel K，Broach J R.Sense and sensibility:nutritional response and signal integration in yeast［J］.Curr.Opin.Microbiol.，2004，7:624-630.

［18］ 秦涵淳，楊臘英，黃俊生，等.培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)的影響［J］.熱帶作報(bào)，2009，30(12):1852-1857.Qan H C，Yang L Y，Huang J S et al.Effect of nutrients in medium on growth of Fusarium oxysporum f.sp.cubense causing fusarial wilt on banana［J］.Chin.J.Trop.Crops，2009，30(12):1852-1857.

［19］ 杜志勇，樊小林.改性石灰氮防治香蕉枯萎病及其恢復(fù)香蕉生產(chǎn)的效果［J］.果樹(shù)學(xué)報(bào)，2008，25(3):373-377.Du Z Y，F(xiàn)an X L.Results of banana fusarium wilt control and banana reproduction in degraded orchard by use of modified lime nitrogen［J］.J.Fruit Sci.，2008，25(3):373-377.

［20］ Borrero C，Avile's M.Effect of ammonium/nitrate ratio in nutrient solution on control of fusarium wilt of tomato by Trichoderma asperellum T34［J］.Plant Pathol.，2011，10:1365-3059.

［21］ Marschner H，R?mheld V.In vivo measurement of root induced pH changes at the soil root interface:effect of plant species and nitrogen source［J］.Z.Pflanzenernaehr.Bd.，1983，111:241-251.

［22］ Raven J A.Biochemical disposal of excess H+in growing plants?［J］.New Phytol.，1986，104:175-206

［23］ 林妃，高劍，曾會(huì)才，等.海南省香蕉枯萎病病原菌的分離鑒定及1號(hào)4號(hào)小種的生物學(xué)特性［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29(2):314-321.Lin F，Gao J，Zeng H C et al.Isolation and identification of banana vasicular wilt in Hainan province and determination of biological characteristics of strains Focr1 and Focr4［J］.Genomics Appl.Biol.，2010，29(2):314-321.

［24］ Snoeijers S S，De Wit P J.The effect of nitrogen on disease development and gene expression in bacterial and fungal plant pathogens［J］.Eur.J.Plant Pathol.，2000，106:493-506.

［25］ Di Pietro A，Ron cero M I.A MAP kinase of the vascular wilt fungus Fusarium oxysporum is essential for root penetration and pathogenesis［J］.Mol.Microbiol.，2001，39:1140-1152.