解春寶，喻 華，肖代雯，楊永長，姜 偉，劉 華，黃文芳

（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院 檢驗科，四川 成都610072）

金 屬 β－內(nèi) 酰 胺 酶 （metallo－beta－lactamase，MBL）是β－內(nèi)酰胺酶的一種，它屬于Ambler分子分類法中的B類。其主要特征是除單氨類抗生素（如氨曲南）以外，可水解碳青霉烯酶類等各種β－內(nèi)酰胺類抗生素，該酶可被金屬螯合劑EDTA或巰基類化合物所抑制，但不能被常見的β－內(nèi)酰胺酶抑制劑（如克拉維酸）所抑制。MBL見于銅綠假單胞菌、不動桿菌和腸桿菌科細(xì)菌。但近幾年報道［1］MBL在腸桿菌科中的檢出率有明顯上升的趨勢。因此，快速而準(zhǔn)確的檢測出產(chǎn)MBL的腸桿菌科細(xì)菌顯得尤為重要。本研究基于MBL必須依賴少數(shù)金屬離子（主要是Zn2＋）的存在而發(fā)揮催化活性，選用金屬離子的螯合劑EDTA·Na2協(xié)同美羅培南（MEM）可起協(xié)同抗菌作用來檢測對碳青霉烯酶類抗生素敏感性降低腸桿菌科細(xì)菌的MBL。

1 材料與方法

1．1 儀器與試劑

全自動微生物分析儀VITEK－2以及VITEK－2配套藥敏試驗復(fù)合板購自法國梅里埃公司；離心機(jī)Microfuge 18Centrifuge購自美國貝克曼庫爾特公司；PCR擴(kuò)增儀、電泳儀和凝膠成像儀購自美國Bio－Rad公司；EDTA·Na2購自美國Sigma公司；美羅培南紙片、空白紙片均購自英國Oxoid公司；M－H瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板均購自鄭州安圖綠科生物公司；GoldViewTM核酸染料購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；瓊脂糖粉購自上?；蚣夹g(shù)有限公司；2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker II購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；引物由上海英駿公司合成。

1．2 菌株來源及鑒定

對碳青霉烯類抗生素敏感性降低的腸桿菌科細(xì)菌共27株，其中肺炎克雷伯菌9株、陰溝腸桿菌8株、粘質(zhì)沙雷菌2株、產(chǎn)氣腸桿菌2株、奇異變形桿菌2株、大腸埃希菌1株、弗勞地枸櫞酸桿菌1株、植生拉烏爾菌1株、日維溝腸桿菌1株，所有菌株均用法國梅里埃公司的全自動微生物分析儀VITEK－2鑒定到種。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922購自溫州康泰生物技術(shù)公司。

1．3 試驗方法

1．3．1 EDTA協(xié)同法篩查MBL 將－80℃保存的所有實驗菌株和大腸埃希菌ATCC25922復(fù)蘇后接種麥康凱瓊脂平板，35℃，6．5%CO2培養(yǎng)24h。挑取單個菌落用生理鹽水將每株菌稀釋成0．5麥?zhǔn)蠁挝坏拇龣z菌懸液涂布M－H瓊脂平板。將美羅培南紙片和空白紙片相距1cm貼在M－H瓊脂平板上，然后在空白紙片上加10μl 0．5MEDTA·Na2。在35℃，6．5%CO2孵育18小時后觀察結(jié)果。美羅培南抑菌環(huán)在靠近加EDTA·Na2紙片側(cè)明顯擴(kuò)大者為產(chǎn)MBL菌株。

1．3．2 PCR檢測 MBL DNA提?。簩⑿迈r細(xì)菌懸濁于200μl dH2O，沸水浴10min，12 000rpm離心5min，上清即為DNA模板。采用PCR法檢測各MBL基因的引物序列和目的產(chǎn)物長度見表1。PCR反應(yīng)體系（20μl）：10μl 2×Taq PCR Master－Mix，正反向引物各1μl（10μmol／L），2μl DNA 模板，6μl dH2O。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，Tm℃退火1min（根據(jù)引物Tm值確定各基因合適的退火溫度），72℃延伸1min，30個循環(huán)周期，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后用Bio－Rad凝膠成像儀檢測并成像。MBL基因擴(kuò)增陽性的PCR產(chǎn)物送上海英駿生物工程有限公司測序，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析。

表1 MBL基因引物序列及目的產(chǎn)物長度

2 結(jié)果

2．1 EDTA協(xié)同法結(jié)果

從對碳青霉烯類抗生素敏感性降低的27株腸桿菌科細(xì)菌中檢測出4株菌產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，美羅培南抑菌環(huán)在靠近加EDTA·Na2紙片側(cè)明顯擴(kuò)大（圖1A）。對照所用大腸埃希菌ATCC25922試驗結(jié)果為陰性（圖1B）。

2．2 PCR結(jié)果

PCR檢測所有試驗菌株的MBL的基因NDM－1A、NDM－1B、VIM、SIM 均為陰性，而IMP陽性有4株，且該4株與EDTA協(xié)同法檢測出的4株相一致。擴(kuò)增陽性的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果，見圖2。測序的DNA與GenBank數(shù)據(jù)庫提供基因進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)該序列與IMP－4的序列完全相同（圖3），說明該4株菌所產(chǎn)MBL均為IMP－4型。

圖1 EDTA協(xié)同法結(jié)果

圖2 IMP基因擴(kuò)增陽性測序部分峰圖

圖3 IMP擴(kuò)增陽性的DNA與GenBank比對后的結(jié)果

3 討論

腸桿菌科細(xì)菌作為社區(qū)獲得性感染和院內(nèi)感染的重要病原菌，可引起呼吸道、尿道等各種部位的感染。碳青霉烯類抗生素是治療該類細(xì)菌感染的最有效藥物之一，但近年來由于該類抗生素的大量、不合理使用加速了臨床腸桿菌科細(xì)菌耐藥菌株的產(chǎn)生，其耐藥主要機(jī)制之一是產(chǎn)生MBL，嚴(yán)重威脅著人類健康。MBL發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)60年代中葉，但編碼該MBL的基因攜帶可移動DNA片段在革蘭陰性菌中播散是在20世紀(jì)90年代才被發(fā)現(xiàn)［4］。MBL是β－內(nèi)酰胺酶的一種，它必須依賴少數(shù)金屬離子（主要是Zn2＋）的存在而發(fā)揮催化活性。根據(jù)氨基酸序列的不同MBL可分為不同的類型，迄今發(fā)現(xiàn)有40多種。腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的MBL主要包括NDM－1、IMP、VIM、KHM－1、GIM－1和SIM－1。其主要特征是除單氨類抗生素（如氨曲南）以外，可水解碳青霉烯酶類等各種β－內(nèi)酰胺類抗生素。因此有必要快速而準(zhǔn)確的檢測出產(chǎn)MBL的腸桿菌科細(xì)菌。

目前國內(nèi)外利用PCR技術(shù)檢測MBL被認(rèn)為是最為準(zhǔn)確的方法［5］?？僧a(chǎn)生 MBL的基因有多種，PCR法通常一種引物只能檢測到一種產(chǎn)MBL的基因，導(dǎo)致該技術(shù)檢測的MBL比較單一，且其步驟繁瑣、價格昂貴，不適合在臨床微生物實驗室用作常規(guī)檢驗。EDAT協(xié)同法就是利用EDTA是一種較強(qiáng)的金屬離子螯合劑，可結(jié)合鋅離子而使其失去活性，導(dǎo)致試驗中出現(xiàn)抑菌環(huán)擴(kuò)大的現(xiàn)象來檢測MBL。據(jù)文獻(xiàn)［6－10］報道EDAT協(xié)同法檢測 MBL的準(zhǔn)確率較高，均在90%以上。

本研究利用EDTA協(xié)同法從27株對碳青霉烯類抗生素敏感性降低的腸桿菌科細(xì)菌中檢測出4株菌產(chǎn)生明顯的協(xié)同效應(yīng)，且該4株菌與PCR檢測出結(jié)果相一致。4株菌所產(chǎn)MBL均為IMP－4型。表明EDTA協(xié)同法檢測對碳青霉烯類抗生素敏感性降低腸桿菌科細(xì)菌的MBL具有較高的準(zhǔn)確性、方法簡便、可操作性強(qiáng)、結(jié)果可靠，適用于臨床對產(chǎn)MBL腸桿菌科細(xì)菌的快速篩查，從而更好的指導(dǎo)臨床的合理用藥。

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