国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

布魯氏菌omp28基因的克隆、表達(dá)及重組蛋白的反應(yīng)原性分析

2013-10-09 06:11王秀麗蔣玉文毛開(kāi)榮丁家波程君生
中國(guó)獸藥雜志 2013年6期
關(guān)鍵詞:布魯氏菌克隆氨基酸

王秀麗,蔣玉文,毛開(kāi)榮,丁家波,程君生,王 楠

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,目前報(bào)道的布魯氏菌外膜蛋白有7種,免疫印跡從羊種布魯氏菌中發(fā)現(xiàn)外膜蛋白28(OMP28)是用于診斷的重要抗原。在印度也有不同的實(shí)驗(yàn)室用OMP28-ELISA檢測(cè)布魯氏菌的抗體,且效果良好[1-3]。將OMP28蛋白的核酸序列在 GenBank中BLAST搜索,發(fā)現(xiàn)有21個(gè)布魯氏菌株含有與羊種布魯氏菌16M株的omp28序列同源性為100%的序列,11株同源性為99%,且細(xì)微的差別對(duì)蛋白的生物活性不造成影響,證明omp28在布魯氏菌中是非常保守的序列,所以對(duì)omp28基因的克隆與表達(dá)對(duì)于新的布魯氏菌抗體檢測(cè)方法的研究有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑 羊種布魯氏菌16M株、羊種布魯氏菌M28株、犬種布魯氏菌、綿羊附睪種布魯氏菌、牛種布魯氏菌A19株、豬種布魯氏菌S2株由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存;羊布魯氏菌病陽(yáng)性血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供,感受態(tài)細(xì)胞BL21、DH5α由天根生化科技有限公司提供;pET32a載體由本實(shí)驗(yàn)室保存,rTaq酶、Eco RⅠ內(nèi)切酶、XhoⅠ內(nèi)切酶、simple pMD18-T載體由大連寶生物(TaKaRa)公司提供。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴(kuò)增 用DNA快速提取試劑盒提取羊種布魯氏菌16M株、羊種布魯氏菌M28株、犬種布魯氏菌、綿羊附睪種布魯氏菌、牛種布魯氏菌A19株、豬種布魯氏菌S2株的基因組,參考GenBank公布的布魯氏菌16M株的omp28基因序列,用Mega4.0分析軟件對(duì)omp28基因進(jìn)行序列分析,設(shè)計(jì)上游引物Fomp28和下游引物Romp28,在上游和下游引物上分別添加Eco RⅠ和XhoⅠ 酶切位點(diǎn)。并將omp28基因的終止子TAA去掉,并添加一個(gè)堿基A使其在載體中正確表達(dá)。引物序列如下:Fomp28,CGGAATTCATGAACACTCGTGCTAG,(劃線(xiàn)部分為 Eco RⅠ的酶切位點(diǎn)),Romp28,CGGCTCGAGACTTGATTTCAAAAAC(劃線(xiàn)部分為XhoⅠ的酶切位點(diǎn)),以Fomp28、Romp28為引物,按94℃ 10 min,94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃2 min(30 個(gè)循環(huán)),72℃ 10 min的程序擴(kuò)增目的片段。用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR擴(kuò)增的結(jié)果,用瓊脂糖凝膠DNA玻璃奶純化回收試劑盒回收目的片段。

1.2.2 omp28基因的克隆、核酸序列/氨基酸序列比對(duì)及親水性分析 估算T載體與目的片段之間的摩爾比,控制在1∶3~1∶8之間,將擴(kuò)增的不同種布魯氏菌omp28基因分別與T載體連接,篩選陽(yáng)性克隆,送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將不同種布魯氏菌omp28基因的測(cè)序結(jié)果以及基因編碼的氨基酸序列用Mega4.0分析并進(jìn)行序列比對(duì)。分別對(duì)omp28基因編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行親水性分析。

將羊種布魯氏菌16M株的omp28基因序列在GenBank中BLAST,搜索與omp28基因核苷酸序列相似性較高的基因。

1.2.3 pET32a-omp28表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將羊種布魯氏菌16M株的omp28基因的T載體克隆和pET32a載體同時(shí)用Eco RⅠ和XhoⅠ雙酶切,回收酶切產(chǎn)物,將omp28基因亞克隆到pET32a表達(dá)載體中,篩選陽(yáng)性克隆,經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定正確后送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序,陽(yáng)性克隆命名為pET32a-omp28。

1.2.4 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 取鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒以及pET32a空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到BL21宿主細(xì)胞中,挑取pET32a-omp28重組菌單菌落接種于100 mL含100μg/mL Amp的 LB液體培養(yǎng)基中,在37℃以200 r/min的速度振蕩培養(yǎng)5 h。加入IPTG至終濃度為1 mmol/L,分別在37℃和28℃ 200 r/min誘導(dǎo)表達(dá)6 h。挑取pET32a空質(zhì)粒重組菌單菌落在37℃同上振蕩培養(yǎng)5 h后加入終濃度為1 mmol/L的IPTG繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)6 h,作為對(duì)照。

將誘導(dǎo)后菌液45 mL以10000 r/min離心,將沉淀重懸于15 mL PBS中,超聲波裂解菌體,裂解條件為工作5 s,間歇5 s,20個(gè)循環(huán)。處理后再次離心。沉淀再次用30 mL pH 7.4的PBS重懸,分別取菌液離心后上清、經(jīng)超聲波處理后上清、超聲波處理后沉淀200μL,加入50μL 5×loading buffer混勻后煮沸10 min,各取10μL上清液與標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白Maker上樣,恒壓120 V,SDS-PAGE至溴酚藍(lán)電泳至凝膠底部。取下凝膠用30 mL考馬斯亮藍(lán)染色液染色30 min,加50 mL脫色液在脫色搖床上脫色三遍,1 h/次,至條帶清晰,觀察結(jié)果,分析表達(dá)形式。

1.2.5 重組蛋白的 Western-blot分析 SDSPAGE結(jié)束后,通過(guò)Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。120 mA恒流,低溫轉(zhuǎn)印1.5 h。轉(zhuǎn)印完畢,用TBST漂洗后,置于5%的脫脂奶粉中,于4℃冰箱過(guò)夜封閉。然后TBST洗三次,每次5 min。將膜置于1∶50倍稀釋的羊布魯氏菌陽(yáng)性血清中,37℃搖床低速結(jié)合1 h。TBST洗三次,每次5 min。再將膜置于1∶20000倍稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體中,作用1 h。TBST洗三次,每次5 min。最后用OPD底物緩沖系統(tǒng)顯色并觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 不同種布魯氏菌omp28基因擴(kuò)增結(jié)果 以羊種布魯氏菌16M株、羊種布魯氏菌M28株、犬種布魯氏菌、綿羊附睪種布魯氏菌、牛種布魯氏菌A19株、豬種布魯氏菌S2株的基因組為模板,以Fomp28、Romp28為引物擴(kuò)增出大小為751 bp的omp28基因片段,與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。

圖1 不同種布魯氏菌omp28基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2 不同種布魯氏菌omp28基因的克隆、序列比對(duì)及親水性分析 將羊種布魯氏菌16M株、羊種布魯氏菌M28株、犬種布魯氏菌、綿羊附睪種布魯氏菌、牛種布魯氏菌A19株、豬種布魯氏菌S2株的omp28基因的T載體克隆為模板,以Fomp28和Romp28為引物,分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示,PCR可以擴(kuò)增出與預(yù)期大小(751 bp)一致的條帶,初步證明克隆的質(zhì)粒是正確的(圖2)。

用Mega 4.0對(duì)不同種布魯氏菌的omp28基因測(cè)序結(jié)果及基因編碼蛋白氨基酸的序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示,omp28基因的核苷酸序列在不同種布魯氏菌中總共有6個(gè)位點(diǎn)存在差異,但編碼的蛋白質(zhì)僅有2個(gè)氨基酸發(fā)生變化。序列之間堿基的差異以及對(duì)編碼氨基酸的影響見(jiàn)表1。不同種布魯氏菌OMP28親水性分析結(jié)果顯示,OMP28的親水性區(qū)域主要集中在1~130個(gè)氨基酸形成的多肽段,個(gè)別氨基酸的變化對(duì)整個(gè)蛋白親水性影響不大,而蛋白的抗原決定位點(diǎn)主要集中在親水區(qū)域,因此推斷,該兩個(gè)氨基酸的變化對(duì)OMP28蛋白的抗原性無(wú)影響。

將羊種布魯氏菌16M-omp28基因在GenBank中BLAST,搜索結(jié)果顯示,不同種布魯氏菌及疫苗株omp28基因的相似性在99%以上,而在沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O∶157、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O∶9中不存在。

表1 不同種布魯氏菌omp28基因序列差異及對(duì)氨基酸的影響

2.3 重組表達(dá)載體pET32a-omp28的構(gòu)建及鑒定

以重組質(zhì)粒pET32a-omp28為模板,F(xiàn)omp28、Romp28為引物PCR擴(kuò)增,能擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符合的核酸條帶(圖3)。用Eco RⅠ和XhoⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,切下的小片段與預(yù)期大小一致,與PCR方法擴(kuò)增的片段大小一致,結(jié)果見(jiàn)圖4。

將重組的pET32a-omp28質(zhì)粒送上海生工測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與GenBank中的序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)與公布的16M株omp28基因的相似性為100%,核酸序列、編碼氨基酸序列也與公布的完全一致,說(shuō)明插入載體的序列完全正確且不存在移碼或核苷酸的缺失等現(xiàn)象。

2.4 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 將37℃和28℃誘導(dǎo)的菌體分別經(jīng)超聲波處理后,將菌液離心后的上清、超聲波處理后的上清、超聲處理后的沉淀經(jīng)SDS-PAGE分析,結(jié)果顯示37℃誘導(dǎo)的重組蛋白主要在超聲波處理后的沉淀中,說(shuō)明主要是以包涵體的形式存在,而28℃誘導(dǎo)表達(dá)的菌體重組蛋白主要在超聲波處理后的上清中,說(shuō)明重組蛋白主要是以可溶性的胞漿蛋白的形式存在(圖5)。

2.5 重組蛋白的反應(yīng)原性分析 Western-blot分析結(jié)果表明,pET32a-OMP28重組蛋白無(wú)論是以包涵體形式存在還是以可溶性形式存在,都能與布魯氏菌的陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng),說(shuō)明該蛋白的反應(yīng)原性良好,結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖2 不同種布魯氏菌omp28基因PCR鑒定結(jié)果

圖6 OM P28蛋白W estern-blot反應(yīng)原性分析

3 討論

關(guān)于布魯氏菌的蛋白能否用于布魯氏菌病的診斷,國(guó)內(nèi)外進(jìn)行了大量的研究。不同株布魯氏菌的外膜蛋白在20世紀(jì)80年代首次被鑒定具有免疫原性和抗原保護(hù)力[4]。布魯氏菌的 OMP10、OMP25、OMP31、BCSP等蛋白也都曾經(jīng)有人用原核表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)及對(duì)重組蛋白的抗原性進(jìn)行研究,且證明以上蛋白都有不同程度的反應(yīng)原性[5-8]。

文獻(xiàn)報(bào)道用重組布魯氏菌OMP28蛋白作抗原檢測(cè)布魯氏菌病 IgG抗體效果良好[1-3]?;蛐蛄蟹治龊偷鞍子H水性分析預(yù)測(cè),個(gè)別氨基酸的差異不會(huì)影響OMP28蛋白的抗原性;在GenBank中搜索omp28基因的相似序列,結(jié)果顯示不同種布魯氏菌omp28基因的相似性大于99%,且僅存在布魯氏菌中。因此本研究?jī)H構(gòu)建了具有代表性的羊種布魯氏菌16M-omp28的重組表達(dá)載體,分析OMP28蛋白的反應(yīng)原性。Western-blot結(jié)果表明本研究所獲得的重組OMP28反應(yīng)原性良好,可以作為抗原檢測(cè)布魯氏菌病IgG抗體,解決脂多糖(LPS)作為抗原無(wú)法檢測(cè)粗糙型布魯氏菌感染的問(wèn)題。

布魯氏菌pET32a-OMP28重組蛋白在37℃誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)由于蛋白表達(dá)速度過(guò)快,來(lái)不及折疊即以包涵體的形式沉淀,而通過(guò)28℃低溫誘導(dǎo),該蛋白主要以可溶性形式表達(dá)。選擇28℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)OMP28蛋白不僅有利于OMP28蛋白更好的恢復(fù)天然結(jié)構(gòu),提高抗原的反應(yīng)原性,而且便于蛋白的純化。

在GenBank中搜索布魯氏菌omp28基因的同源序列結(jié)果顯示,omp28基因在與布魯氏菌存在血清學(xué)交叉反應(yīng)的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O∶9、都柏林沙門(mén)氏菌、大腸桿菌 O∶157中不存在,因此,用OMP28蛋白作抗原檢測(cè)布魯氏菌病,可以有效解決布魯氏菌病與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌等血清學(xué)診斷中的交叉反應(yīng),顯示其有良好的應(yīng)用前景。

[1] Michel S Zymunt,Sylvie B aucheron,Niees Vizcino,et al.Sigle Step Purification and Evaluation of Recombinant BP26 Protein for Serological Diagnosisof Brucella ovis Infection in Rams[J].Veterinary Microbiology,2002,87:213 -220.

[2] Pallab Chaudhuri,Rajeev Prasad,Vinth Kumar,et al.Recombinant OMP28 Antigen-based Indirect ELISA for Serodiagnosis of Bovine Brucellosis[J].Molecular and Cellular Prubes,2010,24:142-145.

[3] Gupta V K,Ranjeeta Kumari,Jyoti Vohra,et al.Comparative Evaluation of Recombinant BP26 Protein for Serological Diagnosis of Brucella melitensis Infection in Goats[J].Small Ruminant Resarch,2010,93:119 -125.

[4] Cloeckaert A,Vizanio N,Paquet J Y.Major Outer Membrane Protein of Brucella spp.Past,Present and Future[J].Veterinary Microbiology,2002,90:229 -248.

[5] 陳偉業(yè),王淑杰,王 永.重組布魯氏菌BP26蛋白和OMP31蛋白作為間接ELISA診斷抗原的研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2006,22(6):518 -521.

[6] 楊春華,邱昌慶,曹小安.流產(chǎn)布魯氏菌omp28基因的克隆與原核表達(dá)[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2007,37(6):465 -468.

[7] 宮曉為,景 濤,王國(guó)治.布魯氏菌BP26蛋白的表達(dá)純化及抗原性的研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2009,25(11):1085-1088.

[8] Duraipandian Thavaselvan,Ashu Kumar,Sapana Tiwari,et al.Cloning and Expression of Immunoreactive Brucella melitensis 28 kDa Outer-membrane Protein(OMP28)Encoding Gene and Evaluation of the Potential of OMP28 for Clinical Diagnosis of Brucellosis[J].Med Microbiol,2010,59:421.

猜你喜歡
布魯氏菌克隆氨基酸
9例布魯氏菌病并發(fā)感染性主動(dòng)脈瘤患者臨床診治分析
克隆狼
羊布魯氏菌病的綜合防治措施
羊布魯氏菌病的診斷與治療
羊布魯氏菌病流行情況調(diào)查及綜合防控措施
浙江:誕生首批體細(xì)胞克隆豬
月桂酰丙氨基酸鈉的抑菌性能研究
HPLC法同時(shí)測(cè)定阿膠強(qiáng)骨口服液中4種氨基酸
屬于“我們”
屬于“我們”