彭小兵，蔣玉文，李旭妮，彭國(guó)瑞，王秀麗

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

雞傳染性鼻炎是由副雞嗜血桿菌引起的一種細(xì)菌性傳染病，表現(xiàn)為眼眶下水腫、打噴嚏、產(chǎn)蛋減少［1］，世界各地養(yǎng)禽業(yè)均采用疫苗進(jìn)行免疫接種來(lái)控制該病的發(fā)生。2005年，Blackall等［2］根據(jù) 16S rRNA堿基序列的同源性及生化特性方面的相似性，將副雞嗜血桿菌(Haemophilus paragallinarum)歸入巴氏桿菌科的一個(gè)新屬，即禽桿菌屬(Avibacterium)，副雞嗜血桿菌也因之更名為副雞禽桿菌(Avibacterium paragallinarum)。副雞禽桿菌Hpg－8株(A型)是制備雞傳染性鼻炎滅活疫苗、雞傳染性鼻炎(A+C型)、新城疫二聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)檢驗(yàn)用菌種，《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》(二○○○版)［3］規(guī)定，該菌種在－40℃的保存期為4年。本研究對(duì)不同凍干年代的副雞禽桿菌Hpg－8株菌種分別進(jìn)行了對(duì)SPF雞的毒力測(cè)定和免疫原性試驗(yàn)，為該菌種制定更加合理的保存期提供了參考。

1 材料與方法

1．1 材料 副雞禽桿菌(原名副雞嗜血桿菌)Hpg－8株(CVCC254)，由本實(shí)驗(yàn)室分別于1991年6月19日、1997年10月22日、2001年7月14日、2011年4月14日繁殖凍干，檢定合格后交菌種保藏室－70℃保存。雞肉湯培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室制備，半合成培養(yǎng)基由北京中海生物科技有限公司提供，雞血清由北京元亨金馬生物科技有限公司提供。2月齡SPF母雞、5日齡雞胚均由北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1．2 方法

1．2．1 菌種對(duì)SPF雞的毒力測(cè)定 每批凍干菌種無(wú)菌操作打開，用雞肉湯培養(yǎng)基溶解后卵黃囊接種5日齡雞胚，待雞胚死亡后收取卵黃液，置－20℃保存。取卵黃液按《中華人民共和國(guó)獸藥典》(二○一○年版三部)［4］進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果將卵黃液用雞肉湯培養(yǎng)基稀釋成不同的滴度，每滴度各眶下竇注射2月齡SPF雞5羽，每日觀察記錄雞的發(fā)病情況，觀察7 d。面部出現(xiàn)一側(cè)或兩側(cè)眶下竇及周圍腫脹或流鼻涕或兼有流淚者，判為發(fā)病。

1．2．2 菌種的免疫原性檢定

1．2．2．1 制苗 按《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》(二○○○版)的方法制備油乳劑滅活疫苗，配苗前的菌體懸液濃度為56億/mL。置2～8℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2．2 免疫 取制備好的疫苗恢復(fù)至常溫，每批各頸部皮下注射60日齡SPF雞8羽，每羽注射0．5 mL;同時(shí)設(shè)空白對(duì)照雞4羽，每羽注射PBS溶液0．5 mL，與免疫組同條件飼養(yǎng)。

1．2．2．3 攻毒 免疫30 d后，取副雞禽桿菌Hpg－8菌株培養(yǎng)物，用雞肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行30倍稀釋后，對(duì)所有雞眶下竇注射0．2 mL(50～100萬(wàn)CFU)，觀察14 d。

2 結(jié)果

2．1 菌種對(duì)SPF雞的毒力測(cè)定結(jié)果 結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，各凍干年代的菌種在約3萬(wàn)CFU/羽的劑量時(shí)，仍能使SPF雞5/5發(fā)病，均達(dá)到甚至超過(guò)了《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》(二○○○版)的標(biāo)準(zhǔn)(10萬(wàn)CFU/羽劑量使雞5/5發(fā)病)。

表1 不同凍干年代副雞禽桿菌Hpg-8株對(duì)SPF雞的毒力試驗(yàn)結(jié)果

2．2 菌種的免疫原性檢定結(jié)果 如表2所示。結(jié)果表明，1991、1997、2011年凍干的菌種在制苗后免疫SPF雞，分別能使雞8/8、7/7、7/7免受副雞禽桿菌強(qiáng)毒的攻擊，達(dá)到了《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》(二○○○版)的標(biāo)準(zhǔn)(對(duì)照組4/4發(fā)病時(shí)，免疫組至少6/8保護(hù)或?qū)φ战M3/4發(fā)病時(shí)，免疫組至少7/8保護(hù))。

表2 不同凍干年代副雞禽桿菌Hpg-8株的免疫原性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

作為疫苗生產(chǎn)檢驗(yàn)用菌種，保持良好的毒力和免疫原性是生產(chǎn)合格疫苗和開展檢驗(yàn)工作的前提和關(guān)鍵，因此對(duì)凍干菌種在一定保存期內(nèi)的毒力和免疫原性是否仍保持原有標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行探索具有重要意義。然而，迄今為止尚未有關(guān)于副雞禽桿菌保存期試驗(yàn)的相關(guān)報(bào)道。該菌培養(yǎng)物以非凍干的形式直接在2～8℃或－20℃保存，其自然死亡率均很高。《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》(二○○○版)亦規(guī)定，副雞禽桿菌Hpg－8株菌種在－40℃的保存期也僅為4年。在從事雞傳染性鼻炎類滅活疫苗進(jìn)口產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)過(guò)程中注意到，來(lái)自3個(gè)不同國(guó)家的企業(yè)提供的副雞禽桿菌菌種在－20℃的保存期分別為10、13、20年，且菌種經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室復(fù)蘇后其生長(zhǎng)特性及毒力均良好。菌種的復(fù)蘇、復(fù)壯、繁殖、凍干和檢定工作不僅需要投入較長(zhǎng)的時(shí)間，同時(shí)尚需消耗一定數(shù)量的人力、財(cái)力和物力。因此，采用科學(xué)有效的保存方法并制定合理的保存期，既能有效地延續(xù)菌種的固有特性，又可避免不必要的資源浪費(fèi)，并可提高工作效率。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，真空凍干菌種于－70℃保存10、14、20年，其毒力仍能滿足要求;真空凍干菌種于－70℃保存14、20年，其免疫原性仍能滿足要求。因此，制定更長(zhǎng)副雞禽桿菌Hpg－8株菌種的保存期顯然是必要的，并且是可行的。

副雞禽桿菌Hpg－8株菌種在各年代繁殖凍干時(shí)均按《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》(二○○○版)的標(biāo)準(zhǔn)檢定了全部項(xiàng)目，本次試驗(yàn)對(duì)不同保存年代菌株的毒力和免疫原性重新進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果均符合規(guī)定，表明該菌株于－70℃保存20年，仍可作為鼻炎類疫苗制品的生產(chǎn)檢驗(yàn)用菌種。

［1］ 陸承平．獸醫(yī)微生物學(xué)［M］．北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007:144－147．

［2］ BlackallPJ，ChristensenH，BeekenhamT，etal．Reclassification ofPasteurella gallinarum，［Haemophilus］ paragallinarum，Pasteurellaavium andPasteurellavolantium asAvibacterium gallinarumgen．nov．，comb．nov．，Avibacteriumparagallinarum comb．nov．，Avibacteriumaviumcomb．nov．a(chǎn)ndAvibacterium volantiumcomb．nov［J］．IntJSystEvolMicrobiol，2005，55(Pt1):353－362．

［3］ 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品規(guī)程委員會(huì)．中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程二○○○版［S］．

［4］ 中國(guó)獸藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)獸藥典三部二○一○版［S］．