孫建宏，劉景利，胡井雷，張從祿，韓正博，戴志紅，楊 帆，徐姍姍

(1．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，哈爾濱 150001;2．中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

國(guó)家獸用生物制品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是控制和確定獸用生物制品產(chǎn)品質(zhì)量、校準(zhǔn)驗(yàn)證檢驗(yàn)儀器和方法是否準(zhǔn)確的物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，是正確診斷傳染病、準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)免疫情況的物質(zhì)基礎(chǔ)。禽流感是我國(guó)重點(diǎn)防控的重大動(dòng)物疫病，H9亞型流行很廣泛［1－2］。目前禽流感診斷、免疫監(jiān)測(cè)及其疫苗免疫效果評(píng)價(jià)中應(yīng)用最廣泛的方法是HI試驗(yàn)，但是我國(guó)尚無(wú)H9亞型診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，嚴(yán)重影響了前后不同時(shí)期檢測(cè)數(shù)據(jù)的一致性和不同實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的可比性。近年各級(jí)實(shí)驗(yàn)室對(duì)禽流感標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的需求越來(lái)越多，因此研制禽流感病毒H9亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原參考品尤為迫切。我單位在國(guó)家現(xiàn)行的禽流感病毒H9亞型血凝抑制方法基礎(chǔ)上［3］，研制出了禽流感病毒H9亞型血凝抑制抗原國(guó)家參考品。

1 材料與方法

1．1 材料 A型禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/10/01株(簡(jiǎn)稱CKSH01株，H9N2)，由國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室鑒定、保管和供應(yīng)。SPF雞及SPF雞胚均由哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1．2 禽流感病毒H9亞型血凝抑制抗原標(biāo)準(zhǔn)品的制備 按照常規(guī)方法，將毒種接種SPF雞胚，收獲雞胚液制備禽流感病毒H9亞型血凝抑制抗原半成品，經(jīng)滅活、濃縮，進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、效價(jià)測(cè)定后，按每瓶1 mL分裝凍干，批號(hào)為200901。保護(hù)劑采用本課題研制的配方和配制方法。

1．3 抗原檢驗(yàn)

1．3．1 物理性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)、剩余水分測(cè)定和真空度測(cè)定 按文獻(xiàn)方法［4］進(jìn)行。

1．3．2 特異性檢驗(yàn) 采用血凝抑制試驗(yàn)的方法［4］，用該抗原分別對(duì)禽流感病毒H5亞型、H7亞型和H9亞型陽(yáng)性血清、雞新城疫陽(yáng)性血清、減蛋綜合征病毒陽(yáng)性血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)。

1．3．3 抗原效價(jià)的定值 按照紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)96孔微量板法進(jìn)行測(cè)定?？乖冗M(jìn)行10倍、20倍、80倍稀釋，然后依次進(jìn)行 320、400、480、560、640、720、800倍…依次遞增80倍進(jìn)行稀釋。先由本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定HA效價(jià)，再由7家具有資質(zhì)且事先經(jīng)過(guò)比對(duì)確認(rèn)其定值能力相同的試驗(yàn)室，采用同一方法進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定［5］。對(duì)該批參考品任抽2個(gè)樣品，每個(gè)樣品在不同時(shí)間段分別作3次獨(dú)立測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定間隔不少于3 d。所獲得的6個(gè)數(shù)據(jù)應(yīng)按統(tǒng)計(jì)學(xué)方法檢驗(yàn)異常值，如發(fā)現(xiàn)有異常值，應(yīng)予標(biāo)明，并補(bǔ)做一次測(cè)定。所有用于定值測(cè)量的計(jì)量器具/測(cè)量?jī)x器需經(jīng)檢定或校準(zhǔn)合格，并在有效期內(nèi)［2］。匯總?cè)吭紨?shù)據(jù)，考察測(cè)量數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性。在數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布或近似正態(tài)分布的情況下，將每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的所測(cè)數(shù)據(jù)的平均值視為單次測(cè)量值，構(gòu)成一組新的測(cè)量數(shù)據(jù)。剔除可疑值。計(jì)算出總平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。當(dāng)全部數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布或近似正態(tài)分布情況下，也可視其為一組新的測(cè)量數(shù)據(jù)。剔除可疑值，再計(jì)算全部原始數(shù)據(jù)的總平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差［5］。

1．3．4 均一性檢驗(yàn) 因凍干數(shù)量在500支以上，所以隨機(jī)取樣15支［5］。分別稱量每支內(nèi)容物的凈重量，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析其均一性。

1．3．5 穩(wěn)定性檢驗(yàn) 抗原在 －20℃、4℃、37℃條件下保存，并定期進(jìn)行HA價(jià)測(cè)定，每一時(shí)間均要進(jìn)行2次重復(fù)測(cè)量，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法從統(tǒng)計(jì)上剔除可疑值，再計(jì)算每次的平均值，該值與定值的偏差應(yīng)不大于標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果

2．1 物理性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)、真空度測(cè)定結(jié)果 均符合規(guī)定。

2．2 剩余水分測(cè)定結(jié)果 4份樣品的剩余水分含量分別為 1．89%、2．35%、2．56% 和 1．69%，均小于3%，符合規(guī)定。

2．3 特異性檢驗(yàn)結(jié)果 表1結(jié)果表明，制備的抗原只能被H9亞型陽(yáng)性血清所抑制，而對(duì)其他陽(yáng)性血清均呈陰性反應(yīng)。

表1 抗原特異性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)表

2．4 抗原效價(jià)的定值結(jié)果 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果見(jiàn)表2。匯總?cè)吭紨?shù)據(jù)，考察全部測(cè)量數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性。經(jīng)描述性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，該批抗原血凝效價(jià)為1∶(460±80)，由于數(shù)據(jù)是非連續(xù)的，變異較大，適合看眾數(shù)和中位數(shù)。眾數(shù)和中位數(shù)都是1∶400，因此將HA效價(jià)定值為1∶400，即400 HAU/支。

表2 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

2．5 均一性檢驗(yàn)結(jié)果 隨機(jī)抽取樣品15支，用電子分析天平分別稱量其凈重量。描述性生物統(tǒng)計(jì)分析得出:樣品重量均在0．112～0．13 g之間，平均數(shù)為0．123 g;CV為4．2%，均在95%正常值范圍內(nèi)，表明該批標(biāo)準(zhǔn)品裝量均一。

2．6 穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果表明，該抗原在37℃條件下保存 3、7、14、21、28 d HA 價(jià)保持 1 ∶400 未下降，35d略降低到1∶256;4℃保存10d、1個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月、6個(gè)月和－20℃保存1個(gè)月、2個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月時(shí)HA價(jià)均未降低，保持在1 ∶400。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)室研制的禽流感抗原各項(xiàng)指標(biāo)經(jīng)檢測(cè)均合格，無(wú)菌、特異、均一、穩(wěn)定，可以作為國(guó)家參考品。但根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特殊要求，－20℃條件下的保存時(shí)間還需每年定期檢測(cè)確定。

［1］ 李建麗，劉國(guó)英，張金花．H9亞型禽流感的流行特點(diǎn)及其疫苗市場(chǎng)分析［J］．獸醫(yī)導(dǎo)刊，2010，(3):69 －71．

［2］ 景小冬，章振華，李 林，等．H9亞型禽流感病毒流行毒株交叉免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)［J］．中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，37(6):134 －137．

［3］ 禽流感病毒H9亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原與陰、陽(yáng)性血清制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程［EB/OL］．［2008 －03 －04］．http://2010jiuban．a(chǎn)gri．gov．cn/xxgkxzsp/t20080304_1028224．htm

［4］ 中華人民共和國(guó)獸藥典二O一O年版三部［S］．

［5］ 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心．一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范(JJG1006－94)［S］．1994．