李 丹，孫 雷，畢言鋒，徐 倩，王鶴佳，徐士新

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 國(guó)家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

球蟲(chóng)病是由一種單細(xì)胞原蟲(chóng)進(jìn)入腸道而引起的一類流行病，在畜禽球蟲(chóng)病中，以雞、兔、牛和羊的球蟲(chóng)病危害最大［1］。氯苯胍、常山酮、氯羥吡啶、氨丙啉均屬于化學(xué)合成類抗球蟲(chóng)藥物(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)，乙氧酰胺苯甲酯屬于抗球蟲(chóng)藥增效劑，與多種抗球蟲(chóng)藥聯(lián)合使用，這五種藥物對(duì)于多種球蟲(chóng)病均有良好的治療效果。由于不規(guī)范使用，抗球蟲(chóng)藥若長(zhǎng)期、持續(xù)添加在飼料中，極容易造成藥物在肉及蛋品中出現(xiàn)殘留，危害人體健康。我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告中嚴(yán)格規(guī)定此五種抗球蟲(chóng)藥在牛、雞肌肉中的最高殘留限量范圍為10～500μg/kg。文獻(xiàn)中，采用HPLC及LC－MS/MS測(cè)定動(dòng)物性組織中氨丙啉、常山酮、氯苯胍等單一藥物的報(bào)道較多，但對(duì)動(dòng)物性組織中氨丙啉、氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍五種藥物同時(shí)檢測(cè)的殘留檢測(cè)方法報(bào)道文獻(xiàn)較少。本研究擬采用LC－MS/MS方法建立雞、牛肌肉中氨丙啉、氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍五種藥物的多殘留檢測(cè)方法，以期為該類藥物的殘留監(jiān)控提供科學(xué)依據(jù)。

圖1 氨丙啉、氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1．1 儀器 ACQUITY UPLC－Quattro Premier XETM質(zhì)譜聯(lián)用儀，Waters公司;AE260電子天平，Mettler Toledo公司;Biofuge Strators高速冷凍離心機(jī)，賀利氏公司;Organomation Associates氮吹儀，Jnc公司;SIR4漩渦混合器，IKA公司。

1．2 試劑與材料 對(duì)照品:氨丙啉、氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍，純度均大于95．0%，Dr．Ehrenstorfer EmbH 公司;乙腈、甲醇為色譜純，F(xiàn)isher公司;乙酸銨為分析純;正己烷為分析純;所用水為超純水。

1．3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和工作液的配制 稱取氨丙啉、氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍對(duì)照品適量，精密稱定，分別置于10 mL棕色量瓶中，甲醇溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;分別精密量取五種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，置同一10 mL棕色量瓶中，用甲醇逐步稀釋成適宜濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1．4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用 50% 甲醇稀釋成濃度均為 10、50、100、200、500 ng/mL的系列混合對(duì)照溶液，量取5種濃度的混合對(duì)照溶液各1．0mL，分別用于溶解預(yù)先按提取凈化吹干后的殘留物，按照樣品前處理方法處理后作為基質(zhì)匹配系列混合對(duì)照溶液，從低濃度到高濃度測(cè)定，每一濃度進(jìn)樣3針，以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．5 UPLC－MS/MS分析條件 色譜條件:色譜柱為 BEH C18色譜柱(50 mm ×2．1 mm，1．7 μm);流動(dòng)相A相為乙腈，B相為20 mmol/L乙酸銨水溶液，梯度洗脫:0～4 min，5%A線性變化至100%A;4～5 min，100%A 線性變化至 5%A;5～6．5 min，維持5%A。流速0．3 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI+)，毛細(xì)管電壓為3．2 kV，萃取電壓為3V，RF透鏡電壓為1V，源溫110℃，脫溶劑溫度350℃，脫溶劑氣速650 L/h，錐孔反吹氣速50 L/h。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)各藥物離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓、碰撞能量見(jiàn)表1。

表1 5種藥物的定性、定量離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量

1．6 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取絞碎后的(2±0．05)g試料，置于50mL離心管內(nèi)，加乙腈8mL，渦旋混合30 s，中速振蕩5 min，8000 r/min離心5 min后，上清液置于另一50 mL離心管內(nèi)，殘?jiān)貜?fù)提取一次。合并兩次上清液，混勻后取出8 mL置于玻璃管中，于50℃水浴中氮?dú)獯蹈?。殘余物?0%甲醇水溶液1．0 mL溶解，再加50%甲醇水溶液飽和的正己烷1．0 mL，渦旋混合30 s，靜置分層后，轉(zhuǎn)移下層溶液至1．5 mL塑料離心管內(nèi)，于 －4℃下13000 r/min離心10min后，吸適量下層溶液過(guò)0．2 μm濾膜后，供液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

1．7 方法學(xué)考察

1．7．1 方法靈敏度確定 將適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到空白組織中，經(jīng)上述方法進(jìn)行前處理后，用UPLC－MS/MS檢測(cè)，觀察藥物特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比(S/N)和對(duì)應(yīng)藥物濃度，S/N＞3，定為方法的檢測(cè)限;S/N＞10，定為方法的定量限。

1．7．2 準(zhǔn)確度和精密度的測(cè)定 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白組織中添加低、中、高三個(gè)不同濃度混合組分進(jìn)行回收率試驗(yàn);各濃度進(jìn)行6個(gè)樣品平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，求批內(nèi)、批間RSD。

2 結(jié)果與討論

2．1 流動(dòng)相的選擇 本研究通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相改善五種藥物的分離效果。分別試驗(yàn)了甲醇－0．1%甲酸水溶液、乙腈－0．1%甲酸水溶液、0．1%甲酸乙腈－0．1%甲酸水溶液、乙腈－20 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相，結(jié)果表明，含有乙腈的流動(dòng)相均優(yōu)于含有甲醇的流動(dòng)相，流動(dòng)相中加入乙酸銨后，分離效果更好。因此，本方法以乙腈－20 mmol/L乙酸銨水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

圖2 空白牛肌肉特征離子質(zhì)量色譜圖

2．2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化 氨丙啉、氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍五種抗球蟲(chóng)藥均屬于弱堿性化合物，易溶于酸性水溶液和極性有機(jī)溶劑。已報(bào)道的提取用溶劑有乙酸乙酯［2］、磷酸鹽緩沖液［3］、乙腈等;用液液萃取、固相萃取等方法凈化，用到的固相萃取柱有 HLB柱［4－5］、堿性氧化鋁柱［6－7］等。經(jīng)過(guò)優(yōu)化處理，本方法采用乙腈進(jìn)行提取，再用正己烷去除脂肪等雜質(zhì)，使得這五種藥物獲得較高的回收率，且前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，省去了采用固相萃取柱凈化的步驟。

2．3 方法線性 5種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液在10～500μg/L的系列基質(zhì)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液范圍內(nèi)，呈良好線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

表2 5種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

2．4 方法靈敏度、回收率和精密度 采用空白組織中添加目標(biāo)化合物的方法，得出5種藥物在樣品中的檢測(cè)限均為5μg/kg，定量限均為10μg/kg。牛肌肉基質(zhì)空白色譜圖見(jiàn)圖2，100μg/kg空白牛肉基質(zhì)匹配試液和100μg/kg空白牛肉添加試液中5種藥物的特征離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 100μg/kg空白牛肌肉基質(zhì)匹配試液中五種藥物的特征離子質(zhì)量色譜圖

圖4 100μg/kg空白牛肌肉添加試液中5種藥物的特征離子質(zhì)量色譜圖

在空白牛、雞肌肉中添加100、200、500μg/kg三個(gè)不同濃度的5種混合組分進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果匯總見(jiàn)表3?？梢钥闯?，5種藥物在空白牛、雞肌肉中的平均添加回收率為75．4% ～109%，批內(nèi)批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。

3 結(jié)論

本研究利用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC－MS/MS)同時(shí)測(cè)定雞肉和牛肉中5種常用抗球蟲(chóng)藥物，方法線性、靈敏度、回收率和精密度等參數(shù)均能滿足獸藥殘留分析方面的要求。

表3 空白牛肉、雞肉中添加5種抗球蟲(chóng)藥的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

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