廖永洪，張?jiān)S科，孫進(jìn)忠，胡東波，谷世江，劉 栓，白朝勇

(1．國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心生物制品研究所，河南洛陽(yáng) 471003;2．普萊柯生物工程股份有限公司，河南洛陽(yáng) 471003)

豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)可引起豬支原體肺炎，又稱地方流行性肺炎，是豬的一種慢性消耗性呼吸道病，臨床感染率極高。其主要癥狀為咳嗽和氣喘，以高發(fā)病率和低死亡率為特點(diǎn)。豬群一旦感染Mhp，便難以清除，不僅嚴(yán)重影響豬群的生長(zhǎng)發(fā)育，用藥量增加，而且容易繼發(fā)感染PRRSV、PCV等，從而導(dǎo)致多種疫苗接種失?。?－2］。豬肺炎支原體作為豬呼吸道病綜合征的重要病原之一，直接或間接對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬肺炎支原體體外培養(yǎng)對(duì)生長(zhǎng)條件要求苛刻，營(yíng)養(yǎng)要求高且生長(zhǎng)速度緩慢，分離過(guò)程中受豬的其他支原體(如豬鼻支原體)的影響，導(dǎo)致豬肺炎支原體分離鑒定難度較大。本研究通過(guò)采集河南各地豬場(chǎng)疑似豬肺炎支原體感染豬病變肺臟，進(jìn)行了豬肺炎支原體的分離、培養(yǎng)，得到一分離株，命名為HN0613株，并對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)特性研究，包括PCR、測(cè)序分析、生化鑒定、生長(zhǎng)抑制和致病性試驗(yàn)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 病料來(lái)源 2006年從河南省各地采集疑似豬支原體肺炎病變肺臟，共16份。

1．1．2 培養(yǎng)基 豬肺炎支原體Friis培養(yǎng)基，BD公司;豬血清，GIBCO公司;酚紅指示劑，美國(guó)AMRESCO公司。

1．1．3 生化試劑 化學(xué)試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，TIANGEN公司;狄氏染色試劑盒，重慶龐通醫(yī)療器械有限公司;生化鑒定試劑，杭州天和微生物試劑有限公司。

1．1．4 陰性、陽(yáng)性血清 兔抗豬肺炎支原體J株特異性血清，由普萊柯生物工程股份有限公司制備。未免兔血清作為陰性血清。

1．1．5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1～2周齡健康仔豬(經(jīng)IDEXX試劑盒檢測(cè)其血清中Mhp及PRRSV抗體，均為陰性)，由河南省伊川縣某豬場(chǎng)提供。

1．1．6 儀器與設(shè)備 生物安全柜(蘇州安泰，BHC－1300ⅡA2)、CO2培養(yǎng)箱(德國(guó) Thermo，Heracell 240Ⅰ)、顯微鏡(Leica，DM750)、PCR 儀(墨西哥BIORAD，PTC0200)。

1．2 方法

1．2．1 病料處理 取疑似支原體肺炎病變肺臟，在超凈臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌手術(shù)剪刀剪取發(fā)病部位邊緣組織，放入無(wú)菌平皿，將病肺組織剪成1～2 mm3碎塊，接種Friis肉湯，37℃培養(yǎng)，每日觀察培養(yǎng)液的pH值變化。培養(yǎng)液變色時(shí)，取第一代經(jīng)0．45μm過(guò)濾器過(guò)濾的培養(yǎng)物0．5 mL接種到1．5 mL含青霉素2000 U/mL的Friis肉湯培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)基變黃后直接取培養(yǎng)物進(jìn)行移植傳代。

1．2．2 形態(tài)學(xué)觀察

1．2．2．1 純化 取0．2 mL培養(yǎng)物涂布于 Friis平板固體培養(yǎng)基表面，置37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每日觀察是否有支原體樣菌落。取支原體樣單個(gè)菌落接種于 Friis肉湯，培養(yǎng)基顏色變黃后取0．2 mL培養(yǎng)物涂布于Friis平板固體培養(yǎng)基表面置37℃，5%CO2條件下進(jìn)行純化培養(yǎng)，如此進(jìn)行純化培養(yǎng)2次。將最后一次純化培養(yǎng)生長(zhǎng)的支原體樣菌落接種Friis液體培養(yǎng)基所得的顏色變黃培養(yǎng)物保存于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2．2 鏡檢 取培養(yǎng)基變黃的培養(yǎng)物和單個(gè)菌落進(jìn)行涂片，分別做革蘭氏染色和瑞氏染色，鏡檢。

1．2．2．3 菌落形態(tài)觀察 按參考文獻(xiàn)［3］進(jìn)行，采用無(wú)菌方法從固體培養(yǎng)基上切下菌落，放到載玻片上，在兩邊墊上竹簽，滴上狄氏染色液后再蓋上一塊玻片，置于4℃染色30 min后，低倍鏡下觀察結(jié)果。

1．2．3 PCR鑒定及測(cè)序分析 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA模板。PCR引物參考文獻(xiàn)進(jìn)行合成［4］。FSp36，5’－ GGGCCGATGAAACCTATTAAAATAGCT－3’Rsp36，5’－GCCGCGAAATTAAATATTTTTAATTGCATCCTG－3’，上海生工合成。PCR 反應(yīng)體系:超純水 34．5μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、引物各2 μL、模板2 μL、TaqDNA聚合酶0．5μL。按下列參數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng):預(yù)變性94℃ 3 min;94℃ 30 s，53℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)后;72℃終延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后取上述產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。直接將有特異性條帶的PCR產(chǎn)物及引物提交至上海生工進(jìn)行測(cè)序分析。

1．2．4 生化試驗(yàn) 生化試驗(yàn)參考文獻(xiàn)［3］進(jìn)行。主要進(jìn)行洋地黃皂甙敏感性試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、葡萄糖分解試驗(yàn)、精氨酸水解試驗(yàn)、三苯基氯化四氮唑(TTC)還原試驗(yàn)、七葉甙水解試驗(yàn)、甘露醇分解試驗(yàn)、薄膜和斑點(diǎn)形成試驗(yàn)。

1．2．5 生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)(GIT)Friis平板接種0．1 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的分離株培養(yǎng)物，將未稀釋的抗血清25μL吸附于滅菌的6 mm濾紙片，將吸有血清的濾紙片貼附于平板表面，培養(yǎng)至菌落可見(jiàn)。正常兔血清處理的紙片作為陰性對(duì)照。培養(yǎng)觀察圓紙片周圍有無(wú)菌落抑制環(huán)的產(chǎn)生。抑制寬度達(dá)1 mm以上時(shí)，判為豬肺炎支原體陽(yáng)性［3］。

1．2．6 代謝抑制試驗(yàn)(MIT) 在10支小管中分別加入1 mL Friis肉湯，于第1支小管內(nèi)加入1 mL兔抗豬肺炎支原體J株特異性血清，混勻后取1 mL于第2支小管，如此進(jìn)行2倍梯度稀釋至第8支小管，混勻后棄去1 mL。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期分離株培養(yǎng)物，用Friis肉湯10000倍稀釋，在第1～9支小管內(nèi)分別加入1mL稀釋培養(yǎng)物，第10支管內(nèi)加入1 mL陽(yáng)性血清，置37℃培養(yǎng)，每天觀察培養(yǎng)液的顏色變化，當(dāng)菌液對(duì)照管顏色變黃時(shí)，小管中培養(yǎng)液顏色未變黃的血清最高稀釋度的倒數(shù)即為抑制價(jià)。取正常兔血清，按以上程序進(jìn)行操作，作為代謝抑制試驗(yàn)的對(duì)照。

1．2．7 分離菌株的致病性 將分離菌株培養(yǎng)物經(jīng)氣管注射1～2周齡健康易感豬3頭，每頭5mL(108CCU)。另設(shè)3頭條件相同的對(duì)照豬，各氣管注射培養(yǎng)基5 mL，作為對(duì)照。試驗(yàn)豬、對(duì)照豬隔離飼養(yǎng)。攻毒后按常規(guī)飼養(yǎng)，飼料中無(wú)抗生素。觀察28 d，每日測(cè)體溫。注射28 d后剖檢，根據(jù)豬支原體肺炎肺病變指數(shù)記分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)試驗(yàn)豬的肺病變進(jìn)行記分。試驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行肺病變指數(shù)差異分析。對(duì)試驗(yàn)豬及對(duì)照豬按1．2．1項(xiàng)進(jìn)行豬肺炎支原體的分離，對(duì)分離株按1．2．3項(xiàng)方法進(jìn)行PCR鑒定。

2 結(jié)果

2．1 培養(yǎng)結(jié)果 16份病料中僅有1份病料接種的培養(yǎng)基7 d后變黃色，過(guò)濾接種后5 d培養(yǎng)液變黃，培養(yǎng)液均勻混濁，轉(zhuǎn)接于含青霉素的Friis培養(yǎng)基，6 d后培養(yǎng)液變色，取培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于固體培養(yǎng)基后，菌落生長(zhǎng)入培養(yǎng)基內(nèi)部。菌落呈典型煎荷包蛋狀，與支原體菌落形態(tài)相符，命名為HN0613株豬肺炎支原體。

2．2 形態(tài)學(xué)觀察 革蘭氏染色未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，瑞氏染色發(fā)現(xiàn)有支原體樣菌體。將固體培養(yǎng)基上菌落經(jīng)狄氏染色后在低倍鏡下觀察，菌落被染成不褪色的中心深藍(lán)色菌落(圖1)，與支原體菌落染色特性相符。

圖1 Friis固體培養(yǎng)基豬肺炎支原體菌落狄氏染色后形態(tài)圖

2．3 PCR鑒定及測(cè)序分析 所提取的分離培養(yǎng)物模板經(jīng)PCR擴(kuò)增后，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，待檢病料或培養(yǎng)物均在750～1000 bp之間接近1000 bp的位置有一條帶，與預(yù)期948 bp相符(圖2)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank中Mhp部分序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示，HN0613分離菌株P(guān)36基因序列與NCBI中公布的Mhp P36基因序列相應(yīng)序列同源性為98%以上。

圖2 PCR鑒定結(jié)果

2．4 生化試驗(yàn) 分離菌株生化反應(yīng)與豬肺炎支原體生化特性相符(表1)。

表1 HN0613分離株生化試驗(yàn)結(jié)果表

2．5 生長(zhǎng)抑制試驗(yàn) 分離株HN0613在吸有抗血清的濾紙片周圍出現(xiàn)了直徑為2．38 mm的抑菌環(huán)，而正常兔血清處理的濾紙片周圍無(wú)抑菌環(huán)。

2．6 代謝抑制試驗(yàn) 培養(yǎng)至第5天時(shí)，菌液對(duì)照管及代謝抑制試驗(yàn)對(duì)照管的培養(yǎng)液均變?yōu)辄S色，血清對(duì)照管培養(yǎng)液顏色無(wú)變化，加有抗血清的第6～8支小管內(nèi)的培養(yǎng)液變?yōu)辄S色，即其代謝抑制價(jià)為64。2．7 分離菌株的致病性試驗(yàn) 將菌株培養(yǎng)物經(jīng)氣管內(nèi)注射10日齡健康易感豬(IHA抗體＜1∶5)，10 d后均相繼出現(xiàn)咳嗽和氣喘等豬支原體肺炎癥狀。28 d后剖檢可見(jiàn)輕度肺病變，病變指數(shù)在9～15之間。而對(duì)照組均未出現(xiàn)上述癥狀及病變，剖檢豬肺部未見(jiàn)異常。臨床觀察和肺部病變結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 HN0613分離株對(duì)仔豬感染情況

對(duì)試驗(yàn)組3頭豬進(jìn)行豬肺炎支原體分離，對(duì)其變色液體培養(yǎng)物按1．2．3項(xiàng)步驟進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果在略小于1000bp處出現(xiàn)特異性條帶(圖2泳道3)，目的條帶大小為948bp，證明分離病原為豬肺炎支原體。

3 結(jié)論

從豬支原體肺炎典型病例的病肺中分離到了疑似豬肺炎支原體的微生物，經(jīng)各項(xiàng)鑒定具有豬肺炎支原體的特性，生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)、代謝抑制試驗(yàn)、PCR及測(cè)序鑒定結(jié)果表明該微生物屬于豬肺炎支原體，命名為豬肺炎支原體HN0613株。豬肺炎支原體HN0613在Friis培養(yǎng)基中培養(yǎng)含量可達(dá)108CCU/mL，對(duì)健康易感豬具有一定的毒力，可致其產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)后咳嗽、氣喘、呼吸困難等支原體肺炎典型的臨床癥狀及肺部肉變。因此該菌株可作為疫苗候選株進(jìn)一步研究。

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［3］ 曹澍澤．獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)［M］．北京:北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1992:49－50．

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