方忠意，班付國，周紅霞，馬 俊，劉占通

(河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州 450008)

喹諾酮類藥物是一類人工合成具有4－喹諾酮環(huán)結(jié)構(gòu)的藥物，因其具有抗菌譜廣、殺菌力強、吸收快、體內(nèi)分布廣泛、不良反應(yīng)小和與其他抗菌藥無交叉耐藥性等特點，被廣泛應(yīng)用于治療動物各類感染［1－3］。目前有部分獸藥企業(yè)為了提高其產(chǎn)品的療效，在氟苯尼考粉中添加喹諾酮類藥物，這種行為容易造成藥物在動物源性食品的殘留、誘導畜禽耐藥菌的產(chǎn)生，最終危害人體健康。本研究旨在建立高效液相色譜法測定氟苯尼考粉中非法添加喹諾酮類藥物的定性定量檢測方法。

1 材料

1．1 儀器設(shè)備 Waters超高效液相色譜儀(帶二極管陣列檢測器);MILLIPORE超純水儀;METTLER XP205電子天平;HANNA pH211C酸度計。

1．2 藥品與試劑

1．2．1 對照品 氧氟沙星對照品，批號H0090912，含量 98．2%;諾氟沙星對照品，批號H0080904，含量99．8%;鹽酸環(huán)丙沙星對照品，批號 H0100803，含量100．0%;恩諾沙星對照品，批號H0080904，含量 99．8%;氟苯尼考對照品，批號K0301004，含量 99．3%;甲砜霉素對照品，批號K0241009，含量99．7%。均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1．2．2 原料藥 氧氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星和恩諾沙星原料藥由河南新正好生物工程有限公司提供，乳酸諾氟沙星由河南亞衛(wèi)動物藥業(yè)有限公司提供。1．2．3 試劑 磷酸，分析純，天津科密歐化學試劑有限公司;三乙胺，分析純，天津科密歐化學試劑有限公司;乙腈，色譜純，Sigma公司;甲醇，色譜純，Sigma公司;水由實驗室MILLIPORE超純水儀自制，符合實驗室一級水要求。

1．2．4 供試品

1．2．4．1 陰性對照氟苯尼考粉 由普萊柯生物工程股份有限公司提供，規(guī)格為100 g∶10 g，質(zhì)量符合《中華人民共和國獸藥典》二〇一〇版一部質(zhì)量標準，經(jīng)檢測不含氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星。

1．2．4．2 陽性添加氟苯尼考粉 考慮到陽性添加試驗需要4種喹諾酮類藥物的量較多，本試驗使用獸藥原料藥代替標準物質(zhì)進行試驗，即在陰性對照氟苯尼考粉中分別添加氧氟沙星、乳酸諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星和恩諾沙星原料藥，混勻，共添加3個含量，分別為1%、2%和5%。

2 方法與結(jié)果

2．1 溶液的制備

2．1．1 對照品溶液的制備 取氧氟沙星、諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星和恩諾沙星對照品約10 mg，分別于10 mL量瓶，精密稱定，加2%磷酸溶液－乙腈(1∶1)適量，超聲15 min使溶解，放冷至室溫后用2%磷酸溶液－乙腈(1∶1)定容至刻度，搖勻，制成1 mg/mL的標準品貯備液。分別取甲砜霉素和氟苯尼考對照品約10 mg于50 mL量瓶，精密稱定，加25%乙腈溶液溶解稀釋至刻度。

2．1．2 供試品溶液的制備 分別稱取1．2．4．2項下的陽性添加氟苯尼考粉1．0 g于50 mL容量瓶，加2%磷酸溶液－乙腈(1∶1)適量，超聲15 min使溶解，放冷至室溫后用2%磷酸溶液－乙腈(1∶1)定容至刻度，搖勻;精密量取5 mL于50 mL容量瓶，加流動相A至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2．2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱為XBridgeTMC18(5 μm，4．6 mm ×150 mm)柱;以A(磷酸3．0 mL加水至1000 mL，用三乙胺調(diào)pH值至3．0±0．1，加乙腈50 mL)－ 甲醇(88 ∶12)為流動相，采用二極管陣列檢測器檢測，采集波長為200～400 nm，分辨率為 1．2 nm;記錄光譜圖和283 nm波長處的色譜圖。分別精密量取2．1．1項下的氧氟沙星、諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星對照品溶液、甲砜霉素對照溶液和氟苯尼考對照溶液適量，配制成50μg/mL的混合標準溶液，量取10μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。該條件下，提取234 nm處的色譜圖，按出峰時間先后順序依次是甲砜霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氟苯尼考和恩諾沙星，相鄰色譜峰的分離度符合要求，結(jié)果見表1，有關(guān)色譜圖和光譜圖見圖1～圖3。

表1 系統(tǒng)適用性試驗數(shù)據(jù)

圖3 4種喹諾酮類藥物的光譜圖(從上到下依次是氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星)

2．3 線性范圍 精密量取2．1．1項下4種喹諾酮類藥物的標準品貯備液適量，用流動相A稀釋成0．25、0．5、1、2、5、10、20、50、100、200 μg/mL 的系列混合標準溶液，從低濃度到高濃度依次進樣，按照2．2項下的色譜條件進樣分析，以標準溶液濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，求得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)(表2)。結(jié)果表明，4種喹諾酮類藥物的濃度在0．5～200μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表2 4種喹諾酮類藥物的線性方程和相關(guān)系數(shù)

2．4 添加回收試驗 按1．2．4．2項下方法制備陽性添加樣品，每個添加含量做5份平行樣，按2．1．2項下方法制備供試品溶液。同時參照2．1．1項下標準溶液方法用氧氟沙星、乳酸諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星和恩諾沙星原料藥制成適當濃度的對照溶液，用于回收試驗的定量計算。按照外標法定量，本實驗的回收率為98．5% ～100．9%，相對標準偏差為0．14% ～0．74%，結(jié)果見表3。

表3 4種喹諾酮類藥物的回收率及相對標準偏差

2．5 檢測限 將2．1．1項下的4種喹諾酮類藥物的貯備液制成混合標準溶液，進行梯度稀釋后添加到陰性對照氟苯尼考粉中，按2．2項下的方法進行檢測，光譜未失真的最低添加含量作為檢測限。本方法的檢測限為0．5 mg/g。

2．6 專屬性試驗 取系統(tǒng)適用性實驗的混合標準溶液進行試驗，采用二極管陣列檢測器檢測，4種喹諾酮藥物能夠很好地分離，氟苯尼考粉中氟苯尼考及其類似物甲砜霉素均不干擾喹諾酮類藥物的檢測。

3 討論

3．1 喹諾酮類藥物在多數(shù)溶劑中溶解性差，一般根據(jù)喹諾酮類藥物在不同pH介質(zhì)中的溶解性來設(shè)計具有一定選擇性的溶解或提取方法［4］。由于獸藥樣品一般溶解稀釋后可直接進行分析，考慮到喹諾酮類藥物的化學性質(zhì)和反相色譜流動相的特點，本研究選擇2%磷酸溶液和乙腈的混合溶液作為溶解液，既能夠很好的溶解喹諾酮類藥物，而且跟后續(xù)的稀釋和HPLC分析的流動相兼容性很好。喹諾酮類藥物具有兩性基團，屬于兩性化合物，反相色譜分析時通常選擇酸性溶液作為流動相，從而抑制色譜峰的拖尾。本研究比較了多款色譜柱和流動相體系，最終選擇了酸性流動相體系和Waters公司的雜化顆粒為載體的XBridgeTMC18色譜柱，能在較短的時間內(nèi)很好地分離了4種喹諾酮類藥物、氟苯尼考及其類似物，各色譜峰之間的分離度均滿足要求，而且色譜峰的峰形比較對稱。研究過程中發(fā)現(xiàn)流動相A中乙腈的量要控制準確，乙腈含量過高導致氧氟沙星和諾氟沙星難以充分分離，乙腈含量過低導致各色譜峰出峰嚴重滯后，影響檢測效率。

3．2 本研究采用二極管陣列檢測器進行檢測，旨在定性定量同時進行。4種喹諾酮類藥物在200～400 nm范圍內(nèi)有特征性的吸收光譜，通過吸收光譜和保留時間兩個指標與標準物質(zhì)進行比較，定性供試品中是否含有本研究中的4種喹諾酮類藥物。諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的最大吸收波長比較一致，氧氟沙星的最大吸收波長與前三種藥物的最大吸收波長差異較大，為了定量檢測，本研究選擇了283 nm處色譜圖用于定量檢測，能夠較好兼顧4種藥物均有較強的吸收。系統(tǒng)適用性試驗中添加了氟苯尼考和甲砜霉素兩種物質(zhì)，主要是研究過程中發(fā)現(xiàn)，氟苯尼考粉制劑中氟苯尼考及可能存在的甲砜霉素對目標化合物的色譜有干擾。選擇234nm處的色譜圖用于系統(tǒng)適用性判定，是因為在283nm處氟苯尼考和甲砜霉素兩種物質(zhì)吸收很弱，而在234nm處6種藥物均有吸收，圖1和圖2為同一次進樣不同波長的色譜圖。

3．3 采用二極管陣列檢測器檢測藥物中非處方成分，容易受到目標分析物以外的化合物的干擾，定性檢測有一定的局限性。由于藥品中的非處方成分是不可預(yù)料的，按照本方法中的色譜條件檢測，也不可避免受到干擾，參考本方法檢測時，若懷疑某種目標化合物受到干擾，建議通過改變色譜條件使目標化合物與干擾物完全分離或用質(zhì)譜方法進行確證，以免造成誤判。

［1］ 陳杖榴．獸醫(yī)藥理學［M］．北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2007．

［2］ 孫 雷，朱馨樂，劉 琪，等．豬肉組織中7種氟喹諾酮類藥物殘留檢測高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法研究［J］．中國獸藥雜志，2008，42(3):12 －15．

［3］ 張玉潔，李 倩，汪 霞，等．高效液相色譜法檢測多種動物組織中氟喹諾酮類藥物殘留量的研究［J］．中國獸藥雜志，2012，46(7):18 －22．

［4］ 李俊鎖，邱月明，王 超．獸藥殘留分析［M］．上海:上?？萍汲霭嫔?，2002．