劉珊珊，韓文瑜，雷連成，馮 新，孫長(zhǎng)江，姚翠梅，高 宇，趙紅蕾

(吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部畜牧獸醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062)

我國屬結(jié)核病高流行地區(qū)，結(jié)核病人數(shù)居全世界第二位，是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一。世界衛(wèi)生組織早在1993年宣布“全球結(jié)核病緊急狀態(tài)”?？ń槊?BCG)是牛型結(jié)核分枝桿菌強(qiáng)毒株經(jīng)13年傳代培養(yǎng)獲得的減毒株，于1921年首次使用。自從1974年世界衛(wèi)生組織正式將其列入免疫接種計(jì)劃以來，已經(jīng)有約40億劑的卡介苗得到接種。目前卡介苗仍是唯一的結(jié)核疫苗，長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用驗(yàn)證其免疫效果大約在接種10～15后年逐漸減弱，對(duì)兒童以及青少年的保護(hù)性受到限制。臨床試驗(yàn)也證實(shí)，BCG免疫不能對(duì)成年人提供良好的保護(hù)效果，更無法預(yù)防潛伏性結(jié)核感染。因此，臨床上迫切需要新的疫苗來控制結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展。

結(jié)核疫苗研究的關(guān)鍵是對(duì)結(jié)核分枝桿菌(MTB)的致病機(jī)制有深入了解。MTB致病機(jī)理復(fù)雜，主要是誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫，因此結(jié)核病不能像其他疾病一樣應(yīng)用傳統(tǒng)疫苗免疫手段得以有效控制，同時(shí)也不能用傳統(tǒng)免疫血清學(xué)方法進(jìn)行有效診斷，目前為止在疫苗研制和檢測(cè)方面均未得到突破性進(jìn)展?；诖?，各國均在加大投入對(duì)結(jié)核病進(jìn)行廣泛深入研究。本文對(duì)結(jié)核疫苗研制進(jìn)展進(jìn)行了闡述。

1 抗結(jié)核感染相關(guān)免疫反應(yīng)

了解MTB感染免疫機(jī)制有利于合理設(shè)計(jì)抗結(jié)核疫苗。MTB是胞內(nèi)感染菌，因其獨(dú)特的蠟質(zhì)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，對(duì)于可溶性抗菌成分顯示出強(qiáng)烈抵抗作用，而肺泡內(nèi)吞噬作用顯得尤為重要，機(jī)體抗MTB感染主要依賴細(xì)胞免疫應(yīng)答，是一類T細(xì)胞介導(dǎo)的、以巨噬細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞的免疫反應(yīng)，包括巨噬細(xì)胞吞噬MTB、抗原遞呈、T淋巴細(xì)胞對(duì)抗原的特異性識(shí)別結(jié)合、抗原增殖和分化、免疫細(xì)胞釋放相應(yīng)細(xì)胞因子、巨噬細(xì)胞激活和殺菌等。調(diào)節(jié)性免疫反應(yīng)對(duì)于結(jié)核感染至關(guān)重要，能夠提供長(zhǎng)期的免疫保護(hù)以防止疾病復(fù)發(fā)。MTB潛伏感染后在機(jī)體免疫力下降的情況下常常會(huì)發(fā)生疾病復(fù)發(fā)甚至進(jìn)入急性感染期?？梢哉f機(jī)體免疫反應(yīng)的強(qiáng)度很大程度上決定了帶菌感染者一生的健康。全世界每年20億結(jié)核感染者中，只有10%會(huì)發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核，而剩下的90%無疑因?yàn)榛颊弑旧硗晟频拿庖呦到y(tǒng)將疾病得以控制［1－2］。而免疫反應(yīng)對(duì)于控制結(jié)核的有效作用在結(jié)核共感染HIV得到另一個(gè)方面的證實(shí):共感染患者中一生中10%可能發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核的幾率擴(kuò)增到1年內(nèi)就有10%可能發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核［3］。

1．1 抗結(jié)核感染相關(guān)細(xì)胞免疫反應(yīng) MTB進(jìn)入機(jī)體后被肺吞噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞吞噬，后者將抗原處理后遞呈給MHC限制性T細(xì)胞［4］。MHC II分子將抗原遞呈給CD4+T細(xì)胞，而CD4+T細(xì)胞輔助細(xì)胞分化成不同亞群，激發(fā)產(chǎn)生相應(yīng)細(xì)胞因子，通常產(chǎn)生IFN－γ、IL－2和TNF－α來進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞。而MHC I類分子將相關(guān)抗原遞呈給CD8+T輔助細(xì)胞，進(jìn)而分化成IFN－γ和TNF－α來激活巨噬細(xì)胞［5］，因MTB表面富含補(bǔ)體受體，感染部位瀕死的巨噬細(xì)胞吸引著單核細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞從而形成局部損傷。IFN－γ信號(hào)同時(shí)還能促進(jìn)吞噬體和溶酶體的融合，從而達(dá)到抵抗MTB的作用。IFN－γ對(duì)于抵抗結(jié)核等胞內(nèi)感染是必不可少的，因其能激活巨噬細(xì)胞，并產(chǎn)生毒性分子從而殺死MTB。激活的巨噬細(xì)胞分泌諸如TNF－α，IL－12，IL－18等細(xì)胞因子。TNF－α對(duì)于誘發(fā)其他炎癥趨化因子和相應(yīng)受體是非常有效的，因此TNF－α和IFN－γ是關(guān)鍵細(xì)胞因子，能促進(jìn)感染性吞噬過程同時(shí)也作為評(píng)價(jià)TH1反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)［6－7］。而 TNF－α 本身作為一個(gè)效應(yīng)因子可以協(xié)同IFN－γ來激活記憶T細(xì)胞是機(jī)體預(yù)防細(xì)胞內(nèi)病原菌再次感染的基礎(chǔ)。而IL－2的共表達(dá)對(duì)于抵抗病毒感染從而保護(hù)宿主而顯得尤為重要(圖1)［8－9］。MTB 在巨噬細(xì)胞和 DC 細(xì)胞中得以存活，對(duì)于結(jié)核的有效控制主要依靠巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞亞群［10］，誘導(dǎo)記憶T細(xì)胞產(chǎn)生是高效疫苗必備條件。

圖1 抗MTB感染相關(guān)的T細(xì)胞亞群［8］

1．2 抗結(jié)核感染相關(guān)體液免疫反應(yīng) 針對(duì)MTB產(chǎn)生的抗體，由于無法接觸到胞內(nèi)菌體，只能對(duì)釋放出巨噬細(xì)胞的細(xì)菌發(fā)揮作用，因此體液免疫反應(yīng)只能起到輔助抗感染作用。體液免疫反應(yīng)對(duì)于抗結(jié)核感染的作用仍沒有得到充分了解，最初研究中發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞缺失的小鼠相對(duì)于野生鼠并未顯示出高易感性。然而近期研究不斷發(fā)現(xiàn)，在這些B細(xì)胞缺陷小鼠中，MTB滴度和因聚集過多的中性粒細(xì)胞而出現(xiàn)的病理損傷相對(duì)高于野生菌［11］。而抗體在某些情況下對(duì)于抵抗MTB感染顯示一定作用，在肺結(jié)核開放期，MTB因表面具有宿主抗MTB抗體從而改變其吞噬細(xì)胞內(nèi)化機(jī)制，使巨噬細(xì)胞趨化作用提高，增強(qiáng)其吞噬溶酶體作用而有效殺死MTB。

1．3 MTB是通過氣溶膠形式傳播感染 多數(shù)病灶集中在感染者肺部，因此有效地開發(fā)區(qū)域黏膜免疫從而控制結(jié)核傳播顯得意義深重。一些研究已經(jīng)驗(yàn)證了黏膜免疫對(duì)于抗結(jié)核感染的顯著作用［12－13］，而該免疫反應(yīng)通常涉及較為復(fù)雜的免疫機(jī)制，包括先天免疫、體液細(xì)胞免疫等，同時(shí)分泌到肺部黏膜的抗菌肽抗菌機(jī)制也參與其中。

2 結(jié)核疫苗研制策略

為了減少全球結(jié)核病的廣泛蔓延，不斷研發(fā)新的疫苗策略，以期達(dá)到對(duì)成年人和兒童都能提供優(yōu)于BCG疫苗的免疫保護(hù)作用。主要研發(fā)策略見圖3。后續(xù)疫苗不僅能夠控制最初感染，而且能夠減少M(fèi)TB的復(fù)制代謝活性，從而將其引入休眠期［14－15］。因此，合適的感染后疫苗也是研發(fā)的熱點(diǎn)，尤其在高感染率地區(qū)，這樣的疫苗顯得尤為必需。

圖3 結(jié)核疫苗研發(fā)策略［11］

2．1 重組BCG疫苗和減毒活性結(jié)核疫苗 重組BCG疫苗是將一些重要抗原尤其是MTB表面蛋白相關(guān)毒力因子導(dǎo)入BCG菌株，如存在于BCG缺失區(qū)域RD1、RD2等一些具有高度免疫活性抗原基因，從而得到一個(gè)重組BCG疫苗，以期能取代傳統(tǒng)BCG 疫 苗，如 rBCGΔureC:Hly(VPM1002)和rBCG30目前已經(jīng)進(jìn)入臨床前期。而MTB減毒活疫苗是敲除MTB的一些基因從而得到基因缺失突變株，MTB減毒活疫苗因其能夠表達(dá)多種抗原從而能激活多功能T細(xì)胞群亞群，顯示出較強(qiáng)的免疫活性。減毒活疫苗比BCG具有更好的保護(hù)作用和安全性［16－17］，目前主要的結(jié)核重組疫苗以及減毒活疫苗見表1。而其他一些減毒疫苗期待在未來幾年內(nèi)陸續(xù)進(jìn)入臨床前期，主要目標(biāo)設(shè)置在基因敲除方面，比如MTBVAC01疫苗是通過敲除轉(zhuǎn)錄調(diào)控子phoP相關(guān)毒力基因而構(gòu)建的［18］。

表1 MTB重組疫苗和減毒疫苗［16］

2．2 亞單位疫苗和活載體疫苗 對(duì)MTB亞單位疫苗研究起源于20世紀(jì)80年代，研究發(fā)現(xiàn)只有活的MTB才能夠提供免疫保護(hù)作用，而死菌則不能，原因在于死菌中缺乏一些毒力因子，而這些毒力因子常常是一些分泌蛋白，并且通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這些分泌蛋白往往通過佐劑能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)［19－20］。盡管隨著蛋白組學(xué)發(fā)展，不斷更新新的方法來分析MTB早期培養(yǎng)濾液，將近有100多種新的表面蛋白被發(fā)現(xiàn)［21］，但目前主要亞單位疫苗候選抗原仍集中在少數(shù)幾個(gè)蛋白上，如Ag85B、ESAT－6和CFP－10等，顯然目前對(duì)于亞單位疫苗候選基因篩選工作只做了很小的一部分，大量工作等待我們?nèi)ラ_展。目前MTB亞單位疫苗主要有兩種類型，一種是由2～3個(gè)MTB主要毒力相關(guān)蛋白構(gòu)成;另一種是表達(dá)一個(gè)或是多個(gè)MTB蛋白的活載體疫苗。重組蛋白疫苗需要相關(guān)佐劑輔助來刺激產(chǎn)生Th1型免疫反應(yīng)，而活載體疫苗則不需要相關(guān)的佐劑，目前研發(fā)的活載體疫苗能產(chǎn)生類似BCG免疫相關(guān)的免疫保護(hù)作用，甚至有些對(duì)于靈長(zhǎng)類動(dòng)物顯示出良好的免疫保護(hù)作用［22］。Ag85B－ESAT－6、Ag85B －TB －10．4(H4，AERAS－404)、M72、MVA85A、Ad35(AERAS －402)等都是這兩個(gè)類型的候選疫苗［23－26］，有的也進(jìn)入臨床一期。活載體疫苗技術(shù)的發(fā)展促使產(chǎn)生了更多的疫苗設(shè)計(jì)新思路，將痘病毒修飾后做為DNA載體來重組重要抗原，聯(lián)合BCG和禽痘重組Ag85A疫苗能激發(fā)出比BCG更強(qiáng)的免疫保護(hù)力。r－MVAAg85疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床一期階段。利用鼠傷寒沙門氏菌減毒株作為載體，將編碼MTB保護(hù)性抗原基因?qū)肫渲?，可?gòu)建重組st疫苗，如rst－Ag85B;而將保護(hù)基因?qū)胄∈缶奘杉?xì)胞或骨髓細(xì)胞則可構(gòu)建結(jié)核活細(xì)胞疫苗，如J774－HSP65疫苗。目前主要的結(jié)核亞單位疫苗見表2。

表2 MTB亞單位疫苗［24］

2．3 DNA疫苗 向宿主體內(nèi)注射DNA載體使宿主通過自身包裝表達(dá)機(jī)制來表達(dá)DNA載體中融合蛋白，從而避免了使用佐劑的副作用，這些抗原通過遞呈MHC I類相關(guān)分子，而誘導(dǎo)CD4+和CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)得到廣泛關(guān)注［27－28］。結(jié)核 DNA疫苗研究領(lǐng)域中 Ag85家族研究最為廣泛，其中Ag85A活性最強(qiáng)［29］。有研究甚至建立多價(jià) DNA疫苗，融合 Ag85B、ESAT － 6、KatG、MPT8．4、MPT12、MPT63、MPT64 和 MPT83 蛋白［30］。目前主要的結(jié)核DNA疫苗見表3。

表 3 MTB DNA 疫苗［31］

有研究發(fā)現(xiàn)，分泌蛋白對(duì)于誘導(dǎo)DNA疫苗有效的保護(hù)作用是必需的，同時(shí)這種DNA疫苗對(duì)于高致病性耐藥臨床結(jié)核分離菌株有高效的保護(hù)作用［31］。Ag85A DNA疫苗也可以作為免疫增強(qiáng)劑，甚至是細(xì)胞因子刺激劑來提高機(jī)體免疫力。比如在給小鼠免疫BCG之前給予Ag85A DNA疫苗免疫，保護(hù)效果從單獨(dú)BCG免疫的0．67log到聯(lián)合免疫后的 1．12log，保護(hù)效果顯著增強(qiáng)［32］。有研究還將IL－12基因融合到Ag85A DNA疫苗中，從而將Ag85A DNA保護(hù)效率提高到與BCG免疫效果相當(dāng)［33］。DNA疫苗的應(yīng)用除了本身的安全問題，我們還必須考慮到這種類型疫苗是否可以應(yīng)用到人類身上，而病毒編碼Ag85A疫苗對(duì)于BCG免疫的增強(qiáng)效果在人類身上也得到證實(shí)，這無疑是個(gè)好的開始，DNA疫苗對(duì)于人類至少可以成為有前景的免疫增強(qiáng)劑，而對(duì)于這種疫苗本身的恐懼并不足以抹殺其對(duì)人類免疫提高的顯著作用。

2．4 滅活疫苗 滅活菌體疫苗感染相關(guān)疾病的危險(xiǎn)性相對(duì)較小，目前結(jié)核疫苗研制在這個(gè)領(lǐng)域主要采取兩個(gè)策略，一是滅活BCG載體疫苗，二是選用一些其他分枝桿菌載體，如熱滅活弱毒性分枝桿菌如Mycobacterium vaccae，具有安全性同時(shí)還能作為抗結(jié)核的免疫治療劑，而滅活Mycobacterium vaccae疫苗已經(jīng)完成臨床3期安全實(shí)驗(yàn)。臨床試驗(yàn)顯示，這類型疫苗能夠提高放射療法和化學(xué)療法的療效，大大縮短治療時(shí)間［33］。

2．5 佐劑研發(fā) 佐劑的功能在過去疫苗研制過程中有所忽視，最近很多研究表明佐劑除了可以增強(qiáng)疫苗免疫原性(如DC靶向提呈)，促進(jìn)免疫細(xì)胞分化成熟，還在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答傾向(Th1或Th2)，甚至改變特異性T細(xì)胞克隆群等過程中都發(fā)揮了重要作用，這對(duì)于抗結(jié)核感染顯得意義重大。在過去的幾年里，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了一些佐劑作為結(jié)核疫苗有效佐劑所具備的有效性和安全性［35］，其中單磷酸酯質(zhì)A(MPL)被廣泛應(yīng)用，尤其與DNA疫苗聯(lián)合使用時(shí)顯示更強(qiáng)的保護(hù)作用，而新一代的氨基烴基類MPL佐劑的藥效研究正積極展開。目前在結(jié)核疫苗研制領(lǐng)域由此也掀起了一場(chǎng)開發(fā)新型佐劑的激烈戰(zhàn)。

2．6 未來結(jié)核疫苗研究方向 未來結(jié)核疫苗研究主要著重兩個(gè)方向，一是感染后疫苗，靶向潛伏期MTB，以期來完全消滅潛伏期MTB，或是降低其復(fù)制感染幾率，從而控制疾病的復(fù)發(fā)，而潛伏表達(dá)相關(guān)抗原就成為該類疫苗的候選基因［36］。另一個(gè)方向就是開發(fā)BCG免疫增強(qiáng)劑，以期增強(qiáng)BCG免疫效果，而篩選的增強(qiáng)劑候選基因必須是能完全消滅MTB的相關(guān)抗原，而不是僅僅將其靶向潛伏期。

3 新的疫苗評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

對(duì)于疫苗評(píng)價(jià)主要是針對(duì)已經(jīng)進(jìn)入臨床前期的相關(guān)疫苗(表4)，通過深入了解MTB相關(guān)免疫機(jī)制和致病機(jī)理，我們必須考慮到這些疫苗的有效性和安全性。有效性至少要比BCG強(qiáng)，安全性至少可以用于HIV高流行地區(qū)，而具體的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表5。

表4 處于臨床階段的結(jié)核疫苗及其接種方法［36］

表5 結(jié)核疫苗評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［36］

4 展望

隨著來自公共基金、政府機(jī)構(gòu)和各項(xiàng)社會(huì)投資的增加，MTB致病機(jī)理、疫苗研發(fā)、疾病診斷等方面研究的不斷深入，預(yù)計(jì)在2015年以前會(huì)有20種左右新結(jié)核疫苗進(jìn)入臨床一期試驗(yàn)，到2015年會(huì)獲得一種有效、安全、廉價(jià)的新結(jié)核疫苗，得以在全球廣泛使用。我們有理由相信，經(jīng)過數(shù)代科學(xué)家們持之以恒的努力，到2050年有可能達(dá)到控制和逐步消滅結(jié)核病的偉大目標(biāo)［37］。

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