喬曉強，王蕊，馬寶偉

（河北大學(xué)藥學(xué)院，河北省藥物質(zhì)量研究重點實驗室，河北保定 071002）

糖基化是蛋白質(zhì)最重要的翻譯后修飾之一，與生物體中多種的分子細(xì)胞機制，包括發(fā)展、生長、通信、特別是癌癥的發(fā)生息息相關(guān)［1］.許多糖基化蛋白質(zhì)已被成功用于醫(yī)學(xué)的治療和診斷，例如her2／neu是乳腺癌的生物標(biāo)記物；CA125是卵巢癌的標(biāo)記物；前列腺特異抗原是前列腺癌的標(biāo)記物［2－3］.因此，對蛋白質(zhì)糖基化的研究具有重要的意義.

然而，許多具有重要生物學(xué)功能的糖基化蛋白質(zhì)往往具有低豐度，如果進(jìn)一步采用蛋白酶酶切，糖基化肽段的比例僅占到總肽段數(shù)目的2%～5%［4］，大大過量的非糖基化肽段會嚴(yán)重干擾后續(xù)的質(zhì)譜（MS）鑒定.因此，發(fā)展高效、高選擇性的富集技術(shù)已成為糖基化蛋白質(zhì)研究必不可少的要務(wù)之一.近年來，包括親水作用色譜法［5－6］、凝集素親和色譜法［7－8］、硼親和色譜法［9－10］以及肼化學(xué)法［11－12］在內(nèi)的多種技術(shù)得到發(fā)展，并成功地實現(xiàn)了糖基化蛋白質(zhì)／肽段的選擇性富集［13］.然而，蛋白質(zhì)糖基化的復(fù)雜性和異質(zhì)性本質(zhì)使得目前發(fā)展的技術(shù)均不能實現(xiàn)復(fù)雜生物樣品中所有糖基化蛋白質(zhì)的富集［14－16］.因此，發(fā)展新穎的糖基化富集技術(shù)對于深入的糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有重要的意義.

熒光檢測具有靈敏度高、選擇性好等特點，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析［17］.在糖基化蛋白質(zhì)研究中，為了增強糖基化蛋白質(zhì)釋放的低聚糖的分析，通常需要對低聚糖進(jìn)行熒光衍生后，再進(jìn)行MS或光學(xué)分析［18］.常用的熒光試劑包括8－氨基萘－1，3，6－三磺酸二鈉鹽（ANTS）和氨基芘－1，3，6－三磺酸（APTS）等，據(jù)筆者所知，該類試劑尚未應(yīng)用于糖基化肽段的選擇性富集研究.

本文發(fā)展了基于熒光標(biāo)簽ANTS的糖基化蛋白質(zhì)選擇性衍生和二氧化鈦（TiO2）親和選擇性富集的N－連接糖基化富集策略（ANTS－TiO2），并將其用于標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白質(zhì)混合物和人血清樣品中N－連接糖基化肽段的富集.與TiO2法直接富集和肼化學(xué)富集法的結(jié)果進(jìn)行比較，實現(xiàn)了互補的N－連接糖基化肽段鑒定.

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

ANTS，馬細(xì)胞色素c，馬肌紅蛋白，牛核糖核酸酶b，雞抗生素蛋白，雞伴清蛋白，人α－1－抗胰蛋白酶以及TPCK處理的胰蛋白酶均購自Sigma（St.Louis，MO，USA）.TiO2購自GL（Tokyo，Japan）.二硫蘇糖醇（DTT）、碘代乙酰胺（IAA）和三氟乙酸（TFA）均購于Acros Organics（Geel，Belgium）.肽N－糖苷酶F（PNGase F）購自New England Biolabs（Ipswich，MA）.堿性磷酸酶（1U／μL）購自上海生工生物工程有限公司.色譜純乙腈（ACN）購自Merck（Darmstadt，Germany）.所有無機試劑均為分析純而其他試劑均為色譜純.實驗用水采用Milli－Q系統(tǒng)（Millipore，Bedford，USA）純化制得.

1.2 蛋白質(zhì)衍生

蛋白質(zhì)衍生過程如下.首先將20μL的人血清與30μL的氧化緩沖液（100mmol／L乙酸鈉，150mmol／L氯化鈉，pH 5.0）均勻混合，然后向其中加入高碘酸鈉使其終濃度為10mmol／L，于室溫避光振蕩反應(yīng)30min.反應(yīng)完畢，向其中加入終濃度為20mmol／L的亞硫酸鈉，繼續(xù)于室溫避光振蕩反應(yīng)10min，以中和過量的高碘酸鈉.最后，向其中順序加入100μL 40mg／mL ANTS（100mmol／L乙酸鈉，pH 6.0）和20μL新鮮配制的1.0mol／L氰基硼氫化鈉溶液，繼續(xù)于室溫振蕩反應(yīng)2h，反應(yīng)完畢，蛋白質(zhì)采用C8固相萃取柱除鹽、冷凍干燥后待進(jìn)一步實驗.

1.3 蛋白質(zhì)酶解

在典型的實驗過程中，首先將20μL的人血清樣品溶解于8mol／L的尿素，蛋白質(zhì)經(jīng)DTT還原和IAA烷基化后，樣品用100mmol／L的碳酸氫銨（pH 8.0）稀釋至尿素濃度低于1mol／L，最后向其中加入胰蛋白酶使得酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1∶20，然后于37℃酶解過夜.為了避免磷酸化肽段的共富集，向上述溶液中加入1μL的堿性磷酸后繼續(xù)于37℃孵育過夜.反應(yīng)完畢，加入甲酸終止反應(yīng).

1.4 N－連接糖基化肽段富集

N－連接糖基化肽段富集分別采用3種方法：ANTS－TiO2法，TiO2法和肼化學(xué)法.ANTS－TiO2法富集過程如下：首先將15mg的TiO2微球和1mg肽段酶解產(chǎn)物以及500μL上樣緩沖（1mol／L乙醇酸，體積分?jǐn)?shù)5%TFA，體積分?jǐn)?shù)85%ACN）均勻混合，并于室溫孵化1h，TiO2微球采用500μL的上樣緩沖清洗2次，以去除未結(jié)合肽段，而糖基化肽段采用500μL體積分?jǐn)?shù)2%的氨水（pH＞11.5）洗脫、除鹽、冷凍干燥后重溶于20μL新鮮配制的100mmol／L碳酸氫銨（pH 8.0）溶液.上述樣品中加入2.5μL的PNGase F并于37℃孵浴過夜，反相除鹽、冷凍干燥后重溶于20μL含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液后進(jìn)樣μRPLC－ESI－MS／MS分析.TiO2法富集過程參考ANTS－TiO2富集法，只是實驗過程中不加入熒光標(biāo)簽ANTS.肼化學(xué)富集法參考文獻(xiàn)［12］.

1.5 HPLC分析

HPLC分析在由進(jìn)樣閥（Rheodyne，Cotati，CA，USA）、四元脫氣機、配備四元梯度單元的智能色譜泵、智能熒光檢測器（Jasco，Tokyo，Japan）和C8柱（大連依利特分析儀器有限公司）組成的系統(tǒng)中進(jìn)行.流動相A為純水（含體積分?jǐn)?shù)0.1%TFA），流動相B為體積分?jǐn)?shù)95%的ACN（含體積分?jǐn)?shù)0.1%TFA）.分離梯度如下（體積分?jǐn)?shù)）：0，20%B；25min，80%B；30min，90%B；流速，1.0mL／min.熒光檢測激發(fā)和發(fā)射波長分別為360nm和515nm.

1.6 μRPLC－ESI－MS／MS分析

Paradigm GM4μHPLC（Michrom Bioresources，Auburn，CA，USA）結(jié)合了LCQDUO四級離子阱（LCQ－IT MS，Thermo Fisher，San Jose，CA，USA）的系統(tǒng)用于N－連接糖基化肽段的分析.流動相A為體積分?jǐn)?shù)98%水（含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸），流動相B為體積分?jǐn)?shù)98%的ACN（含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸）.5cm長的C18柱（5μm，20nm）用于標(biāo)準(zhǔn)糖基化肽段的分析，其分離梯度如下（體積分?jǐn)?shù)）：0，0B；40min，40%B；45min，80%B；50min，80%B；流速，5.0μL／min.人血清富集糖基化肽段采用15cm長的C18柱分析，其分離梯度如下：0，0B；5min，5%B；105min，40%B，110min，80%B；125min，80%B；流速，5.0μL／min.

LCQ儀器采用正離子模式，加熱毛細(xì)管溫度為150°C，噴霧電壓為2.5kV，MS／MS掃描碰撞能量為35%.一級質(zhì)譜全掃描質(zhì)量為m／z400～2 000.MS／MS譜圖采用數(shù)據(jù)依賴模式（data－dependent mode），并且針對全掃描中前兩個強度最高峰進(jìn)行子離子碎片掃描.

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用基于SEQUEST算法的BioWorks軟件（版本號3.1）對獲得的MS／MS數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索，檢索參數(shù)設(shè)置如下：數(shù)據(jù)庫，ipi.HUMAN.V3.31；固定修飾，半胱氨酸殘基＋57.0215Ku；可變修飾，天冬酰胺脫乙?；琢虬彼嵫趸?；母離子和碎片離子的質(zhì)量容忍度分別為2Ku和1Ku；胰蛋白酶完全酶切，允許最大2個漏切位點；數(shù)據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為Xcorr≥1.9，2.2，3.75（分別對應(yīng)于＋1，＋2和＋3價離子），ΔCn≥0.26.

2 結(jié)果與討論

2.1 ANTS－TiO2法N－連接糖基化富集

ANTS－TiO2糖基化富集過程包括6步，如圖1所示.1）糖基化蛋白氧化：糖基化蛋白質(zhì)中多糖的順式鄰二醇經(jīng)高碘酸氧化成醛基；2）ANTS衍生：氧化醛基與ANTS的氨基反應(yīng)后再經(jīng)氰基硼氫化鈉還原形成共價的碳氮鍵；3）胰蛋白酶酶解：蛋白質(zhì)混合物經(jīng)胰蛋白酶酶解成肽段；4）糖基化肽段選擇性富集：TiO2選擇性親和標(biāo)記有熒光標(biāo)簽試劑ANTS的糖基化肽段；5）PNGase F處理：N－連接糖基化肽段通過PNGase F酶切后去除糖鏈；6）分析：去糖肽經(jīng)μRPLC－ESI－MS／MS進(jìn)行分離鑒定.

圖1 ANTS－TiO2糖基化富集過程示意Fig.1 Schematic diagram of glycosylation enrichment by ANTS－TiO2strategy

2.2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分析

5種蛋白質(zhì)，細(xì)胞色素c、肌紅蛋白、核糖核酸酶b、抗生素和α－1－抗胰蛋白酶經(jīng)ANTS標(biāo)記后其熒光光譜如圖2所示.細(xì)胞色素c和肌紅蛋白為典型的非糖基化蛋白質(zhì)，而核糖核酸酶b、抗生素和α－1－抗胰蛋白酶為典型的糖基化蛋白質(zhì).從圖2中可以看出所有的糖基化蛋白質(zhì)經(jīng)ANTS標(biāo)記后均發(fā)出亮綠色熒光，而非糖基化蛋白質(zhì)則不能觀測到熒光，這主要是由于ANTS的活性氨基和糖基化蛋白質(zhì)中氧化多糖的醛基反應(yīng)形成共價化合物從而使得糖基化蛋白質(zhì)選擇性標(biāo)識有熒光標(biāo)簽，因而發(fā)出很強的熒光.上述結(jié)果表明，在優(yōu)化的條件下，ANTS可以實現(xiàn)糖基化蛋白質(zhì)的選擇性標(biāo)記.

圖2 5種蛋白質(zhì)經(jīng)ANTS標(biāo)記后的熒光光譜Fig.2 Fluorescence image of five standard proteins respectively labeled by ANTS

進(jìn)一步考察了3種糖基化蛋白質(zhì)的最低檢測限，通過結(jié)合HPLC分析和熒光檢測，核糖核酸酶b、抗生素和α－1－抗胰蛋白酶的檢測限分別達(dá)到59nmol／L（1.2pmol），105nmol／L（2.1pmol）和2.7μmol／L（54pmol）.此外，ANTS衍生的核糖核酸酶b的穩(wěn)定性結(jié)果如圖3所示，其衍生物于室溫放置1周后其熒光強度僅降低了約10%，顯示了ANTS衍生產(chǎn)物具有高穩(wěn)定性，從而利于后續(xù)的富集分析過程.

2.3 蛋白質(zhì)混合物分析

文獻(xiàn)［19］報道TiO2可用于唾液酸糖肽的專一富集.基于此，α－1－抗胰蛋白酶（唾液酸糖蛋白）、抗生素和伴清蛋白（均為中性糖蛋白）組成的糖蛋白質(zhì)混合物用于評價了發(fā)展的ANTS－TiO2富集法.

圖3 核糖核酸酶b的ANTS衍生物穩(wěn)定性Fig.3 Stability of ribounuclease b derivatized by ANTS

蛋白質(zhì)混合物經(jīng)ANTS－TiO2法處理后鑒定結(jié)果如表1所示.抗生素蛋白和伴清蛋白的2條中性糖肽均實現(xiàn)了有效鑒定.α－1－抗胰蛋白酶含有3個已知的N－連接糖基化位點，其中糖基化肽段K.YLGNATAIFFLPDEGK.L成功地實現(xiàn)了鑒定；而另外2個糖基化位點沒有得到鑒定，這可能是由于LCQ的低靈敏度造成的.上述結(jié)果表明ANTS－TiO2法可以同時實現(xiàn)中性糖肽和唾液酸糖肽的選擇性富集.

表1 糖基化蛋白質(zhì)混合物經(jīng)LCQ分析鑒定的糖肽Tab.1 Results of LCQ analysis of N－linked glycopeptides isolated from the three glycoprotein mixture

2.4 人血清N－連接糖基化蛋白質(zhì)分析

進(jìn)一步采用人血清樣品評價了ANTS－TiO2富集法并與TiO2富集法進(jìn)行了比較.如表2所示，20μL人血清采用TiO2法直接富集共鑒定到35個唯一的N－連接糖基化蛋白質(zhì)，其中包括53個唯一的N－連接糖基化位點.而上述樣品采用ANTS－TiO2法處理后，共鑒定到39個唯一的N－連接糖基化蛋白質(zhì)，包括了53個唯一的N－連接糖基化位點.進(jìn)一步比較了糖基化蛋白質(zhì)和糖基化位點的組成，結(jié)合ANTS－TiO2和TiO22種富集方法共鑒定到78個唯一的N－連接糖基化位點，如圖4a所示，其中僅有28（35.9%）個位點為2種方法共同所鑒定的，顯示這2種方法部分的互補性；其共同鑒定的糖基化蛋白質(zhì)占42.3%（22／52）（Fig.4b），進(jìn)一步說明上述2種方法部分的互補性.互補性可能的原因是ANTS－TiO2法針對磺酸化的糖肽，而TiO2法則針對唾液酸糖肽.此外，ANTS－TiO2法的選擇性為42.1%，這與TiO2法直接富集的選擇性相當(dāng)（45.2%）.

表2 比較ANTS－TiO2法、TiO2法以及肼化學(xué)法分析人血清N－連接糖基化蛋白質(zhì)Tab.2 Comparison of N－linked glycosylation identification by ANTS－TiO2，TiO2，and hydrazide chemistry strategies for human serum proteins

圖4 比較ANTS－TiO2法、TiO2法以及肼化學(xué)富集法分析人血清糖基化蛋白質(zhì).Fig.4 Comparison of ANTS－TiO2，TiO2，and hydrazide chemistry strategies for glycoprotein analysis of human serum.

肼化學(xué)法由于具有高效、高選擇性等特點而成為廣泛采用的技術(shù)，目前已應(yīng)用于多種生物樣品的大規(guī)模N－連接糖基化分析［20－22］.因此，進(jìn)一步將實驗中發(fā)展的ANTS－TiO2富集法和傳統(tǒng)的肼化學(xué)富集法進(jìn)行比較.盡管其選擇性（42.1%）略低于肼化學(xué)法（60.8%），但是其共同鑒定的糖基化位點和糖基化蛋白質(zhì)分別僅為37.5%和36.8%（圖4），同樣顯示了部分的互補性.由于ANTS－TiO2富集法與TiO2直接富集和傳統(tǒng)的肼化學(xué)富集法均顯示了部分的互補性，因此，通過結(jié)合多種富集技術(shù)，有望實現(xiàn)復(fù)雜樣品中N－連接糖基化的全面分析.

3 結(jié)論

發(fā)展了基于雙功能團(tuán)熒光標(biāo)簽ANTS選擇性標(biāo)記和TiO2選擇性富集的N－連接糖基化富集新方法.結(jié)果表明，采用該方法可同時實現(xiàn)中性和唾液酸糖基化蛋白質(zhì)的選擇性衍生和糖基化肽段的選擇性富集.進(jìn)一步應(yīng)用于人血清N－連接糖基化分析，該方法與采用TiO2法直接富集以及肼化學(xué)法富集鑒定到的交疊糖基化位點均小于40%，說明這一新方法與傳統(tǒng)方法在糖基化富集方面具有互補性，有望用于復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品N－連接糖基化的高效富集.

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