孫舒玉，何小鵑，羅 丹，呂 誠(chéng)，荊生龍，呂愛(ài)平，喻長(zhǎng)遠(yuǎn)△

(1.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

黃芪為豆科植物膜莢黃芪［Astragalus membranaceus(Fisch)Bge］和內(nèi)蒙古黃芪 ［A.mongholicus Bge］的干燥根［1］，其始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味甘、性溫、歸脾肺兩經(jīng)，有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表、托毒生肌、利水消腫等功效［2］。黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)是黃芪中含量比例最高、免疫活性最強(qiáng)的一類(lèi)物質(zhì)［3］，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、保肝、降血糖、延緩衰老等作用［3～6］。在治療腫瘤的藥物中，順鉑(diamminedichloroplatinum，DDP)是常用的有效化療藥物之一，為治療多種實(shí)體瘤的一線用藥，它的抗瘤譜廣，與其他抗瘤藥沒(méi)有交叉抗藥性，在治療卵巢癌、睪丸癌、成骨肉瘤等多種實(shí)體瘤時(shí)非常有效［7］。在機(jī)體可以耐受的前提下，其劑量越大，對(duì)腫瘤的殺傷效果也越好，但其毒副反應(yīng)也會(huì)越明顯，很容易引起肝腎毒性、耳毒性、胃腸道反應(yīng)等許多不良反應(yīng)［8］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究黃芪多糖對(duì)順鉑治療S180荷瘤鼠的增效減毒作用。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠70只，體質(zhì)量為20～22g，由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為 SCXK(京)2009-0017);S180細(xì)胞株，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)所饋贈(zèng);黃芪多糖(純多糖)，美國(guó)泛華醫(yī)藥公司;RPMI-1640培養(yǎng)基，美國(guó)GiBco公司;胎牛血清(FBS)，美國(guó)GiBco公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 S180細(xì)胞的培養(yǎng) 在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，用完全培養(yǎng)基(10%FBS+1%PS的RPMI-1640培養(yǎng)基)培養(yǎng)S180細(xì)胞。每2 d進(jìn)行1次傳代，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的S180細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 S180荷瘤鼠模型的建立 選擇接種后7 d健康較好的瘤源動(dòng)物，抽吸腹水。將抽出的腹水用無(wú)菌生理鹽水洗1次，調(diào)整濃度為2.5×106cells/mL，每只小鼠腹腔注射0.2mL，連續(xù)傳代2次。然后抽取S180腹水瘤鼠的腹水，離心1100r/8min，再用無(wú)菌生理鹽水將細(xì)胞洗1次，棄上液，將細(xì)胞重懸在3mL無(wú)菌生理鹽水中計(jì)數(shù)，其中腫瘤細(xì)胞活性≥95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106cells/mL。之后用戊巴比妥鈉將BALB/c小鼠麻醉，在小鼠右側(cè)腋窩皮下按照0.2mL/只接種。

1.2.3 動(dòng)物分組 將造模后的60只雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為模型組、DDP組、黃低組、黃低+DDP組、黃高組和黃高+DDP組6組，每組10只;剩余10只用生理鹽水做同樣處理，作為正常組。

1.2.4 給藥方式及取材 造模后第2天各組開(kāi)始給藥。正常組、模型組:生理鹽水0.2mL/只灌胃;DDP組:2mg/kg，0.2mL/只腹腔注射，隔天給藥;黃低組:150mg/kg，0.2mL/只灌胃，連續(xù) 14d;黃低+DDP組:配制150mg/kg的黃芪多糖，0.2mL/只灌胃，連續(xù) 14d;同時(shí)配制 2mg/kg的 DDP，0.2mL/只腹腔注射，隔天給藥;黃高組:300mg/kg，0.2mL/只灌胃，連續(xù) 14d;黃高 +DDP組:配制300mg/kg的黃芪多糖，0.2mL/只灌胃，連續(xù)14d;同時(shí)配制2mg/kg的DDP，0.2mL/只腹腔注射，隔天給藥。給藥14d后稱(chēng)取各組小鼠體質(zhì)量，取血后將各組動(dòng)物處死，取肝臟稱(chēng)重并計(jì)算肝臟指數(shù)，剝離腫瘤、稱(chēng)重并計(jì)算抑瘤率。將小鼠血清-80℃保存，用于檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量。

肝臟指數(shù)=肝臟重量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)。

抑瘤率=［(模型組平均腫瘤重量 -藥物組平均腫瘤重量)/模型組平均腫瘤重量］×100%。

1.2.5 黃芪多糖對(duì)順鉑治療S180荷瘤鼠的聯(lián)合效應(yīng) 根據(jù)金正均公式［9］計(jì)算黃芪多糖與順鉑的聯(lián)合用藥效應(yīng):兩藥合用抑制率:q值=［E(a+b)］/［Ea+Eb-Ea×Eb］。Ea、Eb:兩藥單用時(shí)各自的抑制率，q＜0.85說(shuō)明兩藥合用有拮抗作用，q≥1.15說(shuō)明兩藥有協(xié)同作用，0.85＜q＜1.15說(shuō)明兩藥作用相加。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪多糖對(duì)S180荷瘤鼠的抑瘤作用

表1顯示，與模型組比較，DDP組腫瘤質(zhì)量顯著下降(P＜0.01)，黃高組腫瘤質(zhì)量減輕(P＜0.05)，聯(lián)合用藥組腫瘤質(zhì)量顯著下降(P＜0.01)，且具有量效關(guān)系。

表1 黃芪多糖對(duì)S180荷瘤鼠腫瘤質(zhì)量的影響(±s，n=10)

表1 黃芪多糖對(duì)S180荷瘤鼠腫瘤質(zhì)量的影響(±s，n=10)

注:與模型組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別腫瘤重量(g)模 型 組2.66±0.39 DDP 組 1.41 ±0.24＊＊黃 低 組 2.47±0.40黃 低 + DDP 組 1.11 ±0.23＊＊黃 高 組 2.22±0.56*黃 高 + DDP 組 0.93±0.29＊＊

2.2 黃芪多糖對(duì)順鉑治療S180荷瘤鼠的聯(lián)合效應(yīng)

根據(jù)金氏公式，以及各給藥組的抑瘤率計(jì)算。低劑量黃芪多糖聯(lián)合順鉑的聯(lián)合效應(yīng)如下。

q低=0.5851/(0.4712+0.0744-0.4712×0.0744)=1.15≥1.15。

高劑量黃芪多糖聯(lián)合順鉑的聯(lián)合效應(yīng)如下:

q高=0.6523/(0.4712+0.1676-0.4712×0.1676)=1.17≥1.15，說(shuō)明低劑量黃芪多糖、高劑量黃芪多糖與順鉑有協(xié)同作用。

2.3 黃芪多糖對(duì)順鉑治療S180荷瘤鼠體質(zhì)量的影響

表2顯示，給藥第1天與正常組比較，各組間體質(zhì)量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明分組均一。而給藥第14天時(shí)與正常組比較，DDP組荷瘤鼠的體質(zhì)量明顯降低(P＜0.01);與DDP組比較，黃芪多糖給藥組荷瘤鼠的體質(zhì)量顯著增加(P＜0.01)，聯(lián)合用藥組小鼠的體質(zhì)量也明顯增加(P＜0.05)。

表2 黃芪多糖對(duì)順鉑治療S180荷瘤鼠體質(zhì)量的影響(±s，n=10)

表2 黃芪多糖對(duì)順鉑治療S180荷瘤鼠體質(zhì)量的影響(±s，n=10)

注:與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與 DDP組比較:ΔP＜0.05，Δ ΔP ＜0.01;與正常組比較:#P ＜0.05，##P ＜0.01(圖 1、圖 2同)

組別 第1天(g) 第14天(g)正 常 組20.81±1.10 25.00±2.18模 型 組 20.75±1.10 23.79±2.99 DDP 組 20.70±0.71 16.17±1.07*##黃 低 組 20.40 ±0.55 24.44 ±1.79Δ Δ黃 低 +DDP組 20.64±0.57 18.51±0.53Δ##黃 高 組 20.96 ±0.76 25.28 ±1.34Δ Δ黃 高 +DDP組 20.74±0.72 18.93±0.72Δ##

2.4 黃芪多糖對(duì)順鉑治療S180荷瘤鼠臟器指數(shù)的影響

圖1顯示，與模型組比較，DDP組肝臟指數(shù)明顯降低(P＜0.01)。與DDP組比較，黃芪多糖作用后，荷瘤鼠的肝臟指數(shù)明顯升高(P＜0.01)，聯(lián)合用藥后，低劑量黃芪多糖(P＜0.05)和高劑量黃芪多糖(P＜0.01)均可使荷瘤鼠的肝臟指數(shù)升高。

圖1 黃芪多糖對(duì)順鉑治療S180荷瘤鼠肝臟指數(shù)的影響(n=10)

2.5 黃芪多糖對(duì)順鉑治療S180荷瘤鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量的影響

圖2顯示，與模型組比較，DDP組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量明顯升高(P＜0.05)。與DDP組比較，黃芪多糖作用后，荷瘤鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量明顯降低(P＜0.05)，聯(lián)合用藥后黃芪多糖可使荷瘤鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量降低(P＜0.05)。

圖2 黃芪多糖對(duì)順鉑治療S180荷瘤鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量的影響(n=6)

3 討論

目前，惡性腫瘤已成為威脅人類(lèi)生命健康的疾病之一。順鉑是臨床常用的化療藥物之一，療效明確，但是副作用較大，在機(jī)體內(nèi)順鉑主要是在肝臟、腎臟代謝，所以最容易產(chǎn)生肝腎毒性［10］。因此在治療腫瘤的過(guò)程中，如何減輕藥物毒副作用并增強(qiáng)其療效是目前臨床面臨的問(wèn)題。順鉑的肝毒性是和組織的過(guò)氧化損傷有關(guān)［11，12］，進(jìn)入機(jī)體后順鉑會(huì)引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化，使膜通透性和膜脂流動(dòng)性發(fā)生變化，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生大量有毒的降解物，從而使組織產(chǎn)生氧化損傷［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪多糖對(duì)肝臟有一定的保護(hù)作用，而且能夠有效減輕順鉑對(duì)肝臟的毒副作用。

黃芪是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥和常用中藥，具有扶正固本、固表止汗、補(bǔ)中益氣、生津養(yǎng)血、行滯通痹等功效，是一種常見(jiàn)的扶正中藥［1］。黃芪始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為補(bǔ)氣之要藥。據(jù)《珍珠囊》記載:“黃芪甘溫純陽(yáng)，其用有五:補(bǔ)諸虛不足，一也;益元?dú)?，二?壯脾胃，三也;去肌熱，四也;排膿止痛，活血生血，內(nèi)托陰瘡，五也。正氣虛損是腫瘤發(fā)病的主要原因，中醫(yī)理論認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生和機(jī)體正氣低下有著很緊密的關(guān)系。臨床上，腫瘤病人化療后常見(jiàn)神疲乏力、胃納不佳、少氣懶言等虛象，其中氣虛之象尤為明顯，而黃芪主治氣虛乏力，表虛自汗，氣虛水腫，血虛萎黃等癥［1］，因此常將黃芪應(yīng)用于腫瘤臨床。而黃芪多糖是黃芪中免疫活性最強(qiáng)的一類(lèi)物質(zhì)，是黃芪免疫藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。近年來(lái)對(duì)它的藥理作用研究表明，它能夠提高正常機(jī)體及腫瘤患者淋巴細(xì)胞的免疫功能［3］。

黃芪多糖是一種具有多種生物活性的中藥多糖，本研究顯示，黃芪多糖可以抑制荷瘤鼠腫瘤的生長(zhǎng)，而黃芪多糖與順鉑聯(lián)合用藥后，其抑瘤效果比單用黃芪多糖或單用順鉑都要好，說(shuō)明二者具有協(xié)同作用。另給藥2周后，順鉑組荷瘤鼠的體質(zhì)量明顯減輕，黃芪多糖作用后，聯(lián)合用藥組體質(zhì)量有所提高，提示順鉑對(duì)荷瘤小鼠是有一定毒性的，而黃芪多糖在一定程度上能夠拮抗順鉑對(duì)荷瘤鼠的毒副作用，而黃芪多糖對(duì)順鉑增效減毒的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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