張尊凱，侯 敏，權(quán)宇彤，曹家銘，董 媛，劉 艷

（吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130012）

石吊蘭素是廣泛存在于苦苣苔科（Gesneriacee）吊石苣苔屬植物吊石苣苔（Lveicnotus pauciflorus Maxin）葉和花中的黃酮類(lèi)物質(zhì)[1]，又名巖豆素，內(nèi)華依瓦菊素。石吊蘭素在植物體中以游離形式存在或與糖結(jié)合成甙的形式存在[2]。有顯著的抗結(jié)核桿菌、抗炎、降壓、清除自由基等多種生物學(xué)效應(yīng)[3]。由于石吊蘭素化學(xué)結(jié)構(gòu)上含有酚羥基，所以使其具有弱酸性[4]，進(jìn)而對(duì)石吊蘭素的提取方法多是利用其物理化學(xué)特性。石吊蘭素不溶于水，微溶于甲醇、乙醇。2010版中國(guó)藥典中采用甲醇超聲提取石吊蘭素[5]，也有報(bào)道采用乙醇回流提取石吊蘭素[2]。而對(duì)于石吊蘭素提取工藝的研究卻非常少。盛衛(wèi)國(guó)等采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化了石吊蘭素的提取工藝[6]，不過(guò)正交實(shí)驗(yàn)最終優(yōu)化值只能是實(shí)驗(yàn)所用水平的組合，不是非常準(zhǔn)確。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural network，ANN）和遺傳算法技術(shù)（genetic algorithm，GA）的發(fā)展，二者結(jié)合后，能夠很好的解決這一問(wèn)題，也越來(lái)越多的用于各種生物學(xué)仿真建模和優(yōu)化過(guò)程[7]。Guo等采用ANN-GA法優(yōu)化了乳鏈菌肽發(fā)酵培養(yǎng)基，使乳鏈菌肽產(chǎn)量提高了8倍[8]?；谶z傳算法的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型是以網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)模擬復(fù)雜的大腦神經(jīng)細(xì)胞，同時(shí)模擬自然進(jìn)化過(guò)程搜索最優(yōu)解的方法，直接以逼近度（Da）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行多元非線(xiàn)性分析[9]，比傳統(tǒng)的優(yōu)化方法更直觀，適用性更廣。本文根據(jù)石吊蘭素的理化性質(zhì)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和ANN-GA法考察了其最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石吊蘭全草 河北省安國(guó)市健仁藥材有限公司；石吊蘭素對(duì)照品 上海純優(yōu)生物科技有限公司，純度大于98%；甲醇 色譜純；其余試劑 均為分析純。

TWCL-T型電熱套 鞏義市宏華儀器設(shè)備工貿(mào)有限公司；Agilent 1200 Series型高效液相色譜儀 廣州尚準(zhǔn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 石吊蘭素的提取 取烘干至恒重的石吊蘭藥材粉20g，置圓底燒瓶中回流提取，加入一定體積的提取液煮沸，提取1～3h，并重復(fù)1～3次。合并提取液，蒸干乙醇，并用95%乙醇定容至25mL，得樣品溶液。

1.2.2 HPLC法檢測(cè)石吊蘭素的含量[5]

1.2.2.1 色譜條件 Agilent ZORBAXSB-C18（5μm，4.6mm×250mm）色譜柱，流動(dòng)相：甲醇∶水（68∶32），檢測(cè)波長(zhǎng)334nm，柱溫26℃，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量20μL。

1.2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)定石吊蘭素對(duì)照品適量，加甲醇制成25μg/mL的溶液，即得。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 分別取對(duì)照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，甲醇定容至5mL，混勻后HPLC測(cè)定石吊蘭素含量，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 乙醇濃度對(duì)石吊蘭素提取量的影響 稱(chēng)取石吊蘭樣品適量，置圓底燒瓶中回流提取，按照固液比10∶1，加入體積分?jǐn)?shù)濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇，煮沸，提取1h，重復(fù)兩次，合并提取液，蒸干乙醇，并用95%乙醇定容至25mL，測(cè)定樣品中石吊蘭素含量。

1.2.3.2 提取時(shí)間對(duì)石吊蘭素提取量的影響 稱(chēng)取石吊蘭樣品適量，置圓底燒瓶中回流提取，按照固液比10∶1加入95%乙醇，煮沸，分別提取0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5h。重復(fù)2次，合并提取液，蒸干乙醇，并用95%乙醇定容至25mL，得樣品溶液。

1.2.3.3 固液比對(duì)石吊蘭素提取量的影響 稱(chēng)取石吊蘭樣品適量，置圓底燒瓶中回流提取，分別按照固液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35加入95%乙醇，煮沸，提取1h，重復(fù)兩次，合并提取液，蒸干乙醇，并用95%乙醇定容至25mL，測(cè)定樣品中石吊蘭素含量。

1.2.3.4 提取次數(shù)對(duì)石吊蘭素提取量的影響 稱(chēng)取石吊蘭樣品適量，置于圓底燒瓶中回流提取，按照固液比10∶1加入95%乙醇，煮沸，提取1h，分別重復(fù)1、2、3、4次，合并提取液，蒸干乙醇，并用95%乙醇定分別定容至25mL，測(cè)定樣品中石吊蘭素含量。差較大。但是，當(dāng)隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)過(guò)多時(shí)，特別容易出現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)過(guò)擬和現(xiàn)象[10]。而逼近度函數(shù)能很好的解決隱含節(jié)點(diǎn)和網(wǎng)絡(luò)的擬合情況。逼近度函數(shù)如下：

表1 BBD實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Independent variables and their levels in the Box-Behnken design

式中，MSEc和MSEt分別是訓(xùn)練集和測(cè)試集均方根誤差，nc和nt分別是訓(xùn)練集和測(cè)試集數(shù)據(jù)個(gè)數(shù)，n是訓(xùn)練集和測(cè)試集個(gè)數(shù)之和，c是常數(shù)（本文中c為1.2）。

1.2.6 GA優(yōu)化 采用GA優(yōu)化中適應(yīng)度（Fitness）函數(shù)對(duì)最適ANN模型進(jìn)行優(yōu)化[9]，F(xiàn)itness函數(shù)如下：

1.2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為進(jìn)一步確定最佳提取條件，根據(jù)ANN-GA預(yù)測(cè)的最佳提取條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定石吊蘭素含量，重復(fù)5次，計(jì)算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化石吊蘭素提取條件

以石吊蘭素濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程為Y=0.031X+0.19533，R2=0.9993。

2.1.1 乙醇濃度對(duì)石吊蘭素含量的影響 乙醇濃度與石吊蘭素提取量的關(guān)系如圖1所示。乙醇濃度對(duì)石吊蘭素提取有顯著影響，由圖1可以看出，隨著乙醇濃度的提高，提取液中石吊蘭素的含量逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度為90%時(shí)達(dá)到最大值，此后，提取液中石吊蘭素含量下降，分析認(rèn)為石吊蘭素的極性與90%濃度的乙醇最為接近，所以當(dāng)乙醇濃度為90%時(shí)，其提取率最大。

1.2.4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用4因素3水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，獲得最佳提取工藝，因素水平表見(jiàn)表1。

1.2.5 ANN模型的建立 通過(guò)Matlab 2010a軟件建立ANN模型[7]。ANN模型包括輸入層、隱含層和輸出層。以表2中提取條件為輸入值，以石吊蘭素含量為輸出值。并將輸入層隨機(jī)分成訓(xùn)練集、校正集、測(cè)試集。隱含層對(duì)ANN模型的影響較大，一般情況下，隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)越多，ANN網(wǎng)絡(luò)模擬非線(xiàn)性的能力就越強(qiáng)，隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)過(guò)少，則網(wǎng)絡(luò)不能充分反映輸入節(jié)點(diǎn)與輸出節(jié)點(diǎn)間的復(fù)雜函數(shù)關(guān)系，從而導(dǎo)致測(cè)試誤

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)石吊蘭素含量的影響 提取時(shí)間對(duì)提取液中石吊蘭素含量的影響如圖2所示。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取液中石吊蘭素的含量逐漸增加，2h后，增加速度放緩，并在2.5h時(shí)，提取率達(dá)到最大，之后提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)略有下降，說(shuō)明提取液中石吊蘭素接近飽和。所以選擇最適的提取時(shí)間為2.5h。

2.1.3 固液比對(duì)提取液中石吊蘭素含量的影響 固液比對(duì)提取液中石吊蘭素含量的影響的影響如圖3所示。固液比對(duì)石吊蘭素的提取影響不大，不過(guò)考慮到固液比值較小時(shí)，增加了石吊蘭素提取過(guò)程中的能耗和原料，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，所以選擇最適的固液比為1∶15。

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)提取液中石吊蘭素的影響 提取次數(shù)對(duì)提取液中石吊蘭素的影響如圖4所示，當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)，提取液中石吊蘭素含量最高，且含量不會(huì)隨著提取次數(shù)的增加而提高，說(shuō)明提取2次時(shí)，石吊蘭中的石吊蘭素已經(jīng)最大程度的提取出來(lái)，提取量并不會(huì)隨著提取次數(shù)增加而提高。所以選擇最佳的提取次數(shù)為2次。

2.2ANN-GA優(yōu)化結(jié)果

按照Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。隨后，以表2中提取條件為輸入值，以石吊蘭素含量為輸出值。建立ANN-GA模型優(yōu)化石吊蘭素提取含量。

表2 4因素3水平BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表格Table 2 The design matrix generated for the BBD and the obtained response values

逼近度函數(shù)Da能夠反映模型值和真實(shí)值的接近程度，所以Da值越大，則該隱含節(jié)點(diǎn)就越接近真實(shí)情況。由圖5可見(jiàn)，當(dāng)隱含節(jié)點(diǎn)數(shù)為17時(shí)，Da達(dá)到最大值，所以選擇的ANN模型的隱含節(jié)點(diǎn)數(shù)為17。此時(shí)，模型的R2值為0.9853，表明ANN模型是顯著的。ANN模型建立后，采用GA優(yōu)化該模型，由圖6可見(jiàn)，當(dāng)進(jìn)化至20代時(shí)，F(xiàn)itness函數(shù)達(dá)到最低水平，且隨著進(jìn)化代數(shù)的增加，F(xiàn)itness并沒(méi)有增加。表明模型的擬合度是符合要求的。最終得到石吊蘭素最大提取率為2.395mg/g。此時(shí)，對(duì)應(yīng)的石吊蘭素提取條件為：乙醇濃度84%，提取2.8h，固液比1∶17，提取2次。按照該條件進(jìn)行5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到提取液中石吊蘭素含量為2.35mg/g，與預(yù)測(cè)值誤差為1.88%。與盛衛(wèi)國(guó)等[7]優(yōu)化的提取工藝相比，提取次數(shù)減少，提取時(shí)間有所延長(zhǎng)，石吊蘭素的提取量顯著提高?？梢?jiàn)，相比于正交優(yōu)化法，ANNGA優(yōu)化的模型擬合度更好，具有更好的優(yōu)化能力。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用ANN-GA法優(yōu)化了石吊蘭中石吊蘭素的提取條件，不僅最大程度上提高了石吊蘭素的提取率，同時(shí)也降低了能耗和成本。目前為止，關(guān)于石吊蘭素提取優(yōu)化的報(bào)道還很少，本文為石吊蘭素在工業(yè)上的應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)，具有很廣闊的應(yīng)用前景。

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