張曉麗, 胡玉珍, 李明云, 苗 亮, 陳 炯, 史雨紅, 陸新江

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 寧波 315211)

大黃魚(Pseudosciaena crocea)為暖水性近距離洄游魚類, 主要分布于黃海南部、東海和瓊州海峽以東的南海北部沿岸, 是我國特有的海水養(yǎng)殖種類之一。近年來由于全球環(huán)境破壞, 導(dǎo)致氣候異常, 我國南方沿海地區(qū)常受寒流侵襲, 年年有大黃魚被凍死,遇到凍害嚴(yán)重年份損失尤為慘重, 使大黃魚養(yǎng)殖業(yè)受到嚴(yán)重影響, 故研究大黃魚的抗寒機(jī)理, 具有重要意義。

對魚類及其他水生變溫動物來說, 水溫是影響其自身生理活動的重要活動因子, 低溫會破壞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、影響抗氧化系統(tǒng)[1-3], 孔祥會等[4]研究顯示低溫下鋸緣青蟹(Scylla serrataForskal)SOD、CAT等抗氧化酶活性升高, 是對低溫適應(yīng)的一種積極反應(yīng)。血液與機(jī)體的代謝、營養(yǎng)狀況及疾病有著密切的關(guān)系, 當(dāng)機(jī)體受到外界因子的影響而發(fā)生生理或病理變化時(shí), 會在血液指標(biāo)中反映出來[5-6]。目前在低溫對魚類血液生化指標(biāo)的影響方面已有較多報(bào)道, 如石桂城等[7]的研究顯示當(dāng)水溫由 28℃降至 15℃時(shí), 吉富羅非魚(Oreochromis niloticus)血清ALT和AST活力均顯著升高; Lermen等[8]的研究顯示銀鯰(Rhamdia quelen)經(jīng)過冷刺激后血糖濃度降低, 甘油三酯含量升高; 何福林等[9]、向建國等[10]的研究顯示水溫會影響虹鱒(Salmoirideus)的紅細(xì)胞數(shù)量, 血清酶活性等指標(biāo)[7-8]。

在低溫對大黃魚的影響方面, 目前僅冀德偉等[11]研究了人工低溫脅迫對大黃魚血清生化的影響, 李明云等[12]對低溫脅迫大黃魚肝臟蛋白質(zhì)組進(jìn)行了雙向電泳分析。而養(yǎng)殖大黃魚在自然海區(qū)降溫不同階段抗氧化水平及血清酶含量的變化尚未見報(bào)道。作者通過研究自然越冬季節(jié)水溫降低過程中大黃魚肝臟、肌肉抗氧化水平及血清酶活性的變化來探討水溫對大黃魚抗氧化能力的影響, 以期為大黃魚耐低溫機(jī)理的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)于2008年冬季在浙江象山港灣水產(chǎn)苗種有限公司進(jìn)行, 試驗(yàn)魚為網(wǎng)箱養(yǎng)殖的二齡大黃魚(體長22～25 cm, 體質(zhì)量190～210 g)。每天早、中、晚測量網(wǎng)箱水溫各 1次, 在日平均水溫達(dá)到 20、16、12、10和8 ℃并穩(wěn)定后進(jìn)行取樣, 每次取樣20尾。取樣時(shí)間和水溫如表1。

表1 冬季自然降溫過程中大黃魚取樣時(shí)間Tab. 1 Sampling time of P. crocea during natural cooling in winter

取樣時(shí)將魚快速從水中撈起, 尾靜脈取血, 血樣于4 ℃靜置5 h后, 4 000 r/min低溫離心15 min, 收集上層血清, 冷凍保存待測。同時(shí)取其肌肉和肝臟,液氮速凍后-80℃低溫保存待測。

1.2 方法

1.2.1 肌肉和肝臟抗氧化指標(biāo)的測定

用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒分別測定肌肉和肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性、總抗氧化能力(T-AOC)以及谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量,操作均按照說明書進(jìn)行。

1.2.2 血清生化指標(biāo)的測定

用全自動生化分析儀(日立 7600-110型)測定血清生化指標(biāo), 檢測指標(biāo)為谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、血清脂肪酶(LIP)、腺苷脫氨酶(ADA)、乳酸脫氫酶(LDH)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)9種血清酶。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件包中的單因素方差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并用LSD法進(jìn)行多重范圍比較進(jìn)行分析。結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(x±s),P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 自然降溫不同階段大黃魚肝臟和肌肉中抗氧化指標(biāo)的變化

由圖1可知, 肝臟和肌肉中SOD的變化趨勢截然相反。水溫由20℃降至8℃的過程中, 肝臟中SOD活性逐漸增加, 8℃時(shí)的活性為63.09 U/mg蛋白, 顯著高于 20℃時(shí)的 48.65 U/mg蛋白(P<0.05), 但 16℃→12℃→10℃的降溫過程中SOD活性雖逐漸升高但差異不顯著(P>0.05); 肌肉中 SOD活性總體呈下降趨勢,在 20℃→12℃的降溫過程中活性顯著降低(P<0.05)。水溫由20℃降至16℃時(shí)肝臟中 POD活性由1.04 U/mg蛋白顯著升高至2.10 U/mg蛋白(P<0.05), 之后又顯著降低(P<0.05); 肌肉中 POD活性隨水溫下降而降低,8℃時(shí)活性明顯低于20℃(P<0.05)。肝臟和肌肉中CAT活性均隨水溫的下降呈降低趨勢。8℃時(shí)肝臟中 CAT活性與20、16、12℃這3個(gè)水溫組之間相比均顯著降低(P<0.05); 肌肉中 CAT活性隨著水溫由 20℃降至12℃的過程中顯著降低(P<0.05)。

圖1 自然降溫不同階段大黃魚肝臟和肌肉SOD、POD和CAT活性的變化Fig.1 Changes in activity of SOD, POD and CAT in liver and muscle of P. crocea during natural cooling in winter

總體可見, 3種抗氧化酶在肝臟中的活性均高于肌肉中, 而且自然降溫過程中, 肝臟和肌肉中各種抗氧化酶變化趨勢也存在差異(圖 1)。10℃和 8℃兩水溫組之間, 肝臟和肌肉中SOD、POD及CAT活性變化不明顯。8℃與20℃兩個(gè)水溫組相比, 肝臟和肌肉中的POD和CAT的酶活性均顯著降低(P<0.05)。

由圖2可知, 水溫由20℃降至8℃, 肝臟和肌肉中 GSH含量變化趨勢截然相反, 大黃魚肝臟中GSH含量呈先升高后降低的變化規(guī)律, 即20℃降至16℃時(shí) GSH 含量顯著升高(P<0.05), 達(dá)最大值12.24 nmol/mg蛋白, 水溫降至 12℃時(shí)又顯著下降(P<0.05), 當(dāng)水溫達(dá) 8℃時(shí) GSH含量又顯著降低(P<0.05); 而在肌肉中 GSH含量卻呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢, 即水溫由 20℃降至 12℃時(shí)含量顯著降低(P<0.05), 其含量由2.60 nmol/mg蛋白降至1.28 nmol/mg蛋白。當(dāng)水溫降至 8℃時(shí) GSH含量又顯著升高至2.90 nmol/mg蛋白(P<0.05)。各個(gè)水溫組中肝臟的GSH含量均高于肌肉。在整個(gè)水溫變化過程中, 肝臟中MDA含量呈先升高后降低的變化趨勢, 16℃時(shí)顯著高于其他各水溫組(P<0.05); 肌肉中 MDA含量呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢, 12℃、10℃MDA含量顯著低于其余3組(P<0.05), 而其余3組間差異不顯著(P>0.05)。

圖2 自然降溫過程中大黃魚肝臟和肌肉GSH、MDA含量的變化Fig. 2 Changes in contents of GSH and MDA in liver and muscle of P. crocea during natural cooling in winter

隨著水溫降低, 肝臟和肌肉中總抗氧化能力(T-AOC)隨水溫降低均呈波動變化(圖 3)。肝臟中T-AOC16℃和10℃出現(xiàn)兩個(gè)峰值, 分別為1.13 U/mg蛋白和0.93 U/mg蛋白, 且這兩組顯著高于其余3組(P<0.05), 12℃活性最低為 0.42 U/mg蛋白; 肌肉中T-AOC在 10℃時(shí)最低, 為0.23 U/mg蛋白, 其余各組差異不顯著(P>0.05)。

圖3 自然降溫過程中大黃魚肝臟和肌肉總抗氧化能力(T-AOC)的變化Fig. 3 Changes in total antioxidant capacity (T-AOC)in liver and muscle of P. crocea during natural cooling in winter

2.2 自然降溫不同階段大黃魚血清酶活性的變化

本試驗(yàn)中測定了大黃魚9種血清酶活性, 由圖4可知, 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)隨水溫自然下降酶活性均呈現(xiàn)降低趨勢,即這5種血清酶在水溫為20℃時(shí)活性最高。其中AST酶活性呈現(xiàn)較緩的降低趨勢, 20℃時(shí)酶活性最高, 為84.40 U/L, 與其余 4個(gè)水溫組均具有顯著性差異(P<0.05)。16℃與12℃、10℃與8℃酶活性差異不顯著(P>0.05), 而16℃、12℃的酶活性與10℃、8℃時(shí)相比均呈現(xiàn)差異顯著性; 堿性磷酸酶 ALP活性在10℃時(shí)降至最低點(diǎn), 為4.14 U/L, 而到8℃時(shí)略有回升, 其值為 6.31 U/L; 隨著水溫降低, 乳酸脫氫酶LDH活性降低呈三階段, 20℃和16℃, 12℃和10℃差異不顯著(P>0.05), 而這兩組間差異顯著(P<0.05),當(dāng)水溫降至 8℃時(shí)酶活性明顯降低, 其值為 448.80 U/L, 與其他各個(gè)水溫組間存在顯著性差異(P<0.05);肌酸激酶同工酶 CK-MB, 在水溫開始下降時(shí), 16℃酶活性比20℃有所降低, 但差異不顯著(P>0.05), 水溫繼續(xù)下降至 12℃時(shí)酶活性顯著下降(P<0.05)。CK-MB從 12℃到 8℃降溫過程中保持穩(wěn)定的水平,各水溫酶含量差異不顯著(P>0.05)。

肌酸激酶CK和血清脂肪酶LIP活性隨著水溫降低呈先上升再下降的趨勢。兩種酶在 12℃、10℃時(shí)酶活性較高, 水溫降至8℃時(shí)兩種血清酶活性均降至最低。CK活性在8℃時(shí)降至2435.23 U/L, 與其他各水溫組之間均存在顯著性差異(P<0.05); LIP活性在8 ℃時(shí)與 20、16℃時(shí)數(shù)值接近, 差異不顯著(P>0.05)。

圖4 自然降溫過程中血清酶活性變化Fig. 4 Changes in serum enzyme activity of P. crocea during natural cooling in winter

腺苷脫氫酶ADA和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶GGT活性隨水溫降低呈上升趨勢(圖4)。當(dāng)水溫由20℃降至16℃時(shí) ADA活性由 4.04 U/L顯著升高至 4.53 U/L(P<0.05), 當(dāng)水溫降至 12℃時(shí) ADA活性又顯著升高至 5.30 U/L(P<0.05), 而水溫由 12℃→10℃→8℃過程中ADA活性變化不顯著(P>0.05); 水溫由20℃降至16℃時(shí), GGT活性由1.52 U/L顯著升高至2.07 U/L(P<0.05)。

3 討論

3.1 自然降溫對大黃魚肝臟和肌肉中抗氧化能力的影響

McCond等[13]提出的自由基傷害學(xué)說, 已廣泛用于需氧生物抗逆境傷害機(jī)理的研究。動植物在經(jīng)受環(huán)境脅迫(如低溫、干旱等)過程中產(chǎn)生的損傷在很大程度上與產(chǎn)生過量的活性氧有關(guān)。在通常情況下,動植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧(如H2O2, -OH, O2-等)不足以使動植物受到傷害, 因?yàn)槠潴w內(nèi)有一套行之有效的抗氧化系統(tǒng)可以清除產(chǎn)生的活性氧自由基[14]。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)是體內(nèi)重要的保護(hù)酶, 在清除自由基中起重要作用。水溫是直接影響魚類生理活動的環(huán)境因子,主要對魚類代謝反應(yīng)速率起控制作用從而成為影響魚類活動和生長的重要環(huán)境變量[1]。從本試驗(yàn)的結(jié)果可以看出當(dāng)水溫變化時(shí), 大黃魚肝臟和肌肉中SOD、POD及CAT 3種抗氧化酶的活性也隨之變化。

SOD被認(rèn)為是機(jī)體對抗自然水溫暴露的保護(hù)劑[15]?？紫闀萚4]對低溫馴化鋸緣青蟹鰓抗氧化防護(hù)、ATPase及膜脂肪酸組成變化進(jìn)行了研究, 發(fā)現(xiàn) SOD活性隨水溫的降低而升高。這與本試驗(yàn)肝臟中 SOD活性變化趨勢一致。肝臟中 POD活性僅見 16℃及12℃有顯著升高。李建設(shè)等[16]認(rèn)為在保護(hù)酶系統(tǒng)中,SOD、POD的活性起主要的調(diào)節(jié)作用, 且肝臟是機(jī)體主要的代謝器官, 各種酶種類及含量均較豐富,在機(jī)體適應(yīng)調(diào)解中起重要作用。當(dāng)水溫變化, 肝臟能首先增加相關(guān)酶含量, 來適應(yīng)環(huán)境改變, 所以水溫降低時(shí)肝臟中的SOD和POD活性顯著升高。從自由基傷害學(xué)說的角度解釋出現(xiàn)這種趨勢可能是由于水溫下降后, 機(jī)體受到水溫降低的影響, 產(chǎn)生大量的活性氧自由基, 使機(jī)體需要提高抗氧化酶活性來消除因此帶來的損害。

肌肉中SOD和POD活性隨著水溫的降低呈下降的趨勢, 這與肝臟中呈現(xiàn)相反的變化趨勢, 可能是組織間的差異與肝臟相比肌肉在低溫調(diào)節(jié)的滯后性或不敏感性, 酶的產(chǎn)生速度低于肝臟。也可能是低溫對抗氧化系統(tǒng)有一定程度的影響, 使超氧陰離子自由基、過氧化氫、單態(tài)氧和羥自由基等自由基急劇增加, 它們直接作用于細(xì)胞, 損傷或破壞生物膜系統(tǒng), 造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損害[17-18], 從而使肌肉中的SOD和POD活性下降。

肝臟和肌肉中, CAT活性隨水溫的自然降低均呈下降趨勢, 這可能是由于其敏感性低于其余兩種酶[19-20]。

在整個(gè)自然降溫過程中, 10℃和8℃兩水溫組之間, 肝臟和肌肉中SOD、POD及CAT抗氧化酶的活性變化不明顯, 這可能是由于水溫降低的幅度不夠大或時(shí)間短, 也可能存在其他影響因素; 8℃時(shí)肝臟和肌肉中POD和CAT活性與20℃水溫組相比較均顯著下降, 而低溫刺激肝臟中SOD活性顯著升高。由此可見, 隨水溫的降低大黃魚有一定的氧化應(yīng)激反應(yīng), 為了維持魚體內(nèi)氧自由基的平衡, 在 POD、CAT活性顯著降低時(shí), SOD活性明顯升高, 也可能存在其他影響因素, 有待于后續(xù)研究。

MDA是機(jī)體脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物, 其含量高低間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度,并代表機(jī)體或組織的氧化水平的高低[21]。16℃時(shí)肝臟中 MDA顯著高于其他各水溫組(P<0.05), 這可能是大黃魚為了維持機(jī)體的代謝平衡而增加了脂質(zhì)的代謝, 但由于水溫繼續(xù)降低導(dǎo)致機(jī)體氧化水平降低,所以MDA含量顯著降低。在整個(gè)自然降溫過程, 肌肉中 MDA含量降低后升高, 但與 20℃相比沒有明顯升高, 這也可能是溫度降低肌肉中氧化水平降低。

GSH是生物體內(nèi)重要的抗氧化劑, 由谷氨酸、半胱氯酸及甘氨酸組成, 既可作為谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)的底物, 通過這兩種酶清除活性氧自由基, 又可直接與生物體內(nèi)的氧自由基及親電化臺物結(jié)合, 清除活性氧自由基[22]。Leggatt等[23]和李大鵬等[24]研究表明, 相對高的馴化水溫可增加各組織中GSH含量, 即低溫會使GSH含量下降, 但本文中在水溫下降初期, 肝臟 GSH含量有明顯上升, 之后緩慢下降, 這可能由于降溫初期體內(nèi)活性氧自由基增多, 使機(jī)體提高抗氧化能力有關(guān), 也可能是隨水溫的降低機(jī)體有一定的氧化應(yīng)激反應(yīng), 為了維持魚體內(nèi)氧自由基的平衡GSH含量顯著升高。

T-AOC是總抗氧化能力, 用于衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標(biāo)。T-AOC的大小可代表和反映機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)對外來刺激的代償能力以及機(jī)體自由基代謝的狀態(tài), 由于 T-AOC具有很強(qiáng)的代表性所以是機(jī)體反映體內(nèi)組織抗氧化功能的一個(gè)良好指標(biāo)[25]。對南極魚類和溫帶魚類的比較研究表明, 棲息水溫影響魚體抗氧化水平, 魚體抗氧化能力與水溫之間具有較高相關(guān)性[26]。本試驗(yàn)中隨著水溫降低, 總抗氧化能力隨之波動性變化,8℃、12℃和 20℃時(shí)肝臟中 T-AOC值較低, 可能是在水溫較低和較高時(shí), 魚類機(jī)體內(nèi)自由基增多, 導(dǎo)致防御體系的抗氧化物質(zhì)減少, 從而引起 T-AOC降低[27]。在16℃和 10℃時(shí)最高, 從作者其他抗氧化酶分析, 不難得出16℃時(shí)總抗氧化能力最高, 而10℃時(shí)的升高,有可能是因?yàn)镾OD活性的升高, 也可能是其他抗氧化因素的產(chǎn)生, 如維生素、氨基酸、金屬蛋白質(zhì)等都可能產(chǎn)生抗氧化能力的升高。

從本試驗(yàn)的結(jié)果可發(fā)現(xiàn)肌肉中 GSH含量和T-AOC值均明顯低于肝臟, 可以進(jìn)一步說明肝臟對清除自由基具有重要作用, 在抗氧化調(diào)節(jié)方面起到主要作用, 而肌肉組織表現(xiàn)出一定的滯后性。

3.2 自然降溫對大黃魚血清酶的影響

血清酶是血液學(xué)中最重要的指標(biāo)之一, 絕大部分血清酶是特定的組織器官產(chǎn)生的, 其活性高低與相應(yīng)組織器官的代謝水平和功能狀態(tài)有關(guān), 因此血清酶的變化可在一定程度上反映組織器官功能狀態(tài)的變化, 如 AST可反映肝臟和心臟等器官的細(xì)胞的病變[28]; LDH是糖代謝中催化丙酮酸向乳酸轉(zhuǎn)化的酶, LDH和 CK-MB也可反映心肌的受損程度,CK-MB肌酸激酶是由M和B亞基構(gòu)成的雜化型二聚體, 主要存在于心肌細(xì)胞的外漿層, 是心肌酶譜中最有特異性的酶[29]; ALP是生物體內(nèi)一種重要的代謝調(diào)控酶, 在生物體內(nèi)直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝等生理過程, 對體內(nèi)鈣磷的吸收與代謝、維持體內(nèi)適宜的鈣磷比例起重要作用[30]; 肌酸激酶(CK)是診斷急性心肌梗死重要的酶學(xué)指標(biāo)之一。當(dāng)機(jī)體器官發(fā)生病變時(shí), 器官中的酶會逸出進(jìn)入血液, 而導(dǎo)致血清酶的升高, 以此來判斷器官的損傷。如肝細(xì)胞出現(xiàn)1%異常, 足以使血清中的酶活性增加1倍[31],即在一定程度上反映出水溫對于機(jī)體器官有一定的損傷。但不能完全從器官損壞來解釋越冬季節(jié)血清酶的變化。

當(dāng)適宜水溫下, 酶活性基本保持不變, 但當(dāng)水溫超過適宜的水溫, 酶活性呈快速下降趨勢[30]。本試驗(yàn)中隨著越冬季節(jié)水溫自然下降, 多數(shù)血清酶呈現(xiàn)下降趨勢, 如ALT、AST、ALP、LDH及CK-MB等血清酶, 這幾種酶在 20℃時(shí)活性最高, 這與中華鱘(Acipenser sinensis)幼魚的血清酶ALT、AST和LDH的最適溫度相同[27], 這可能是由于冬季水溫下降,機(jī)體代謝減慢而引起酶活性的下降。而這種變化是否由機(jī)體損傷所致, 還是由代謝等其他原因?qū)е?有待于進(jìn)一步研究。

肌酸激酶 CK是一種分布在骨骼肌和心肌等肌肉組織中的酶, 是神經(jīng)肌肉損傷的酶學(xué)指標(biāo)。CK活性先升高后降低, 這可能由于開始降溫時(shí), 機(jī)體為了適應(yīng)水溫的變化而增加能量代謝所致[32]。CK酶活性在 8℃時(shí)降至 2435.231 U/L, 明顯低于其他各組(P<0.05), 可能是由于水溫過低大黃魚活動減少, 代謝減慢, 某些組織受損或疾病能致機(jī)體免疫功能下降而引起肌酸激酶含量改變,從而導(dǎo)致血清中肌酸激酶活性降低。血清脂肪酸 LIP是催化脂肪代謝的關(guān)鍵酶, 隨水溫降低LIP也先升高再降低, 這可能是由于低溫時(shí)魚類進(jìn)食減少, 機(jī)體轉(zhuǎn)換代謝方式, 代謝體內(nèi)脂肪加劇, 而糖類代謝減少。

GGT和ADA主要來源于肝臟, 是肝細(xì)胞的胞漿酶, 該酶可以作為反映肝實(shí)質(zhì)損傷的指標(biāo)[33]。任何原因造成的肝細(xì)胞損傷, 都會使其肝細(xì)胞膜的通透性就會增強(qiáng), 從而致使血清中的 ADA和 GGT酶的含量升高。本試驗(yàn)中越冬期間隨水溫的降低 GGT和ADA活性均呈上升趨勢, 很可能是水溫的降低對大黃魚的肝細(xì)胞造成損傷, 而使得肝臟中ADA和GGT釋放到血液中所致[10,33], 綜上所述水溫是影響大黃魚的血清酶活性的主要影響因素之一, 從而影響大黃魚的生長代謝。

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