逯凱霄，王棟良，李學紅，劉書琴

（華北制藥集團愛諾有限公司，河北 石家莊052165）

阿維菌素（Avermectin）是由灰黃鏈霉菌發(fā)酵產生的帶雙糖支鏈的十六元大環(huán)內酯類抗生素[1］，由一組結構相近的 A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a、B2b等8個同系物組成，其中阿維菌素B1a的生物活性最高，含量大于90%[2］。

阿維菌素首先由日本北里大學和美國Merck公司開發(fā)為具有殺蟲、殺螨、殺線蟲活性的殺蟲劑[3］，由于其作用機制獨特，對害蟲具有觸殺和胃毒作用[4］，對人畜安全，具有高選擇性和高安全性，是當前生物農藥市場中最受歡迎和具有競爭性的新產品，同時也是農業(yè)部推薦的高毒農藥的首選替代品種之一。

目前，我國阿維菌素制劑的年產量已達萬噸，是微生物農藥中年產值最大的品種[5］。但目前采用的分離方法一般為溶媒提取結晶法[6］，溶劑用量及損耗量大，生產成本高，成為阿維菌素類產品持續(xù)發(fā)展的瓶頸。作者首次采用大孔樹脂對阿維菌素進行分離純化，結果令人滿意。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

阿維菌素發(fā)酵液、雙蒸水，自制；阿維菌素標準品，美國Sigma公司；大孔樹脂D312、HZ816、HZ801，上海華震科技有限公司；大孔樹脂 D101、LX－11、AB－8，西安藍曉科技有限公司；大孔樹脂 Amberlite XAD1600，美國羅門哈斯公司；乙腈（色譜純），美國Merck公司；工業(yè)乙醇，滄州興隆化工有限公司；其它試劑均為國產分析純。

高效液相色譜儀（996檢測器，515泵），Waters公司；Loborata 4000型旋轉蒸發(fā)器，Heidolph公司；TGL－16G型高速離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 色譜條件

色譜柱：Hypersil C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈－水 （90︰10，體積比）；流速：1.0mL·min－1；檢測波長：210nm；進樣量：10μL。阿維菌素保留時間為9.5min。

精密稱取阿維菌素標準品5mg置于50mL容量瓶中，用流動相溶解；再精密移取該溶液5mL置于50 mL容量瓶中，用流動相定容，搖勻，得標準品溶液。取標準品溶液10μL注入色譜儀，采用外標法按上述色譜條件測定。該方法在阿維菌素濃度為0.25～25 μg· mL－1范圍內有良好線性關系（R＝0.9999）；加標回收率（n＝5）為100.8%，RSD為0.89%。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵液預處理及阿維菌素的提取

阿維菌素主要存在于菌絲體內，為了提高固液分離時的過濾速度，在發(fā)酵液中按3∶100（g∶mL）加入珍珠巖，攪拌30min后真空抽濾，水頂洗，得阿維菌素菌絲體。

向阿維菌素菌絲體中按2∶1（mL∶g）加入95%乙醇后攪拌浸提1h，過濾，得1次浸提液；向浸提后的菌絲體中再按2∶1（mL∶g）加入95%乙醇，攪拌浸提1h，過濾，得2次浸提液；合并浸提液，浸提收率為95.21%（n＝3）；50℃下減壓濃縮浸提液至乙醇濃度為50%，待上大孔樹脂柱。

1.3.2 樹脂吸附和解吸

1.3.2.1 樹脂的預處理及再生

樹脂預處理方法：用95%乙醇充分浸泡樹脂1～2次，除去致孔劑，用水反復洗滌至洗滌液無乙醇氣味；用2mol·L－1鹽酸浸泡樹脂4h，水洗至中性；再用2 mol·L－1氫氧化鈉溶液攪拌浸泡4h，水洗至中性后，用50%乙醇平衡，備用。

樹脂再生方法與預處理基本相同。

1.3.2.2 樹脂的篩選

根據(jù)阿維菌素的脂溶特性，選用非極性樹脂D312、HZ816、D101、LX－11、XAD1600及中等極性樹脂HZ801、AB－8共7種型號大孔樹脂作為吸附載體，進行動態(tài)吸附篩選。分別取預處理好的上述樹脂各100mL，重力沉降法裝柱，上端加入濃縮后的阿維菌素浸提液，流速為200mL·h－1，HPLC在線檢測，當流出液中阿維菌素含量為上樣液含量的10%時，樹脂吸附飽和，停止上樣，計算吸附容量。

1.3.2.3 吸附流速的選擇

將等體積濃縮后的阿維菌素浸提液分別以50mL·h－1、100mL·h－1、150mL·h－1、200mL·h－1、250mL·h－1、300mL·h－1的流速通過 HZ816樹脂柱吸附，HPLC檢測流出液中阿維菌素含量。

1.3.2.4 洗脫溶劑的選擇

選用等體積甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇等4種溶劑，對飽和HZ816樹脂進行解吸，HPLC檢測解吸液中阿維菌素的含量，考察洗脫溶劑對解吸收率的影響。

1.3.2.5 洗脫溶劑體積分數(shù)的選擇

取100mL飽和HZ816樹脂用50%乙醇洗滌后，再用不同體積分數(shù)的洗脫溶劑進行洗脫，洗脫速度50 mL·h－1，HPLC在線檢測，考察洗脫溶劑體積分數(shù)對B1a含量、解吸收率的影響。

1.3.3 結晶

合并洗脫液中B1a含量大于90%部分，減壓濃縮至無乙醇流出后，加入95%乙醇至結晶液中，阿維菌素濃度為10mg·mL－1，45℃下加熱溶解，5℃下放置8h，過濾，再于5℃下用乙醇洗滌濾餅，真空干燥，得到白色阿維菌素粉末。

2 結果與討論

2.1 樹脂篩選結果

考察了7種大孔樹脂對阿維菌素的動態(tài)吸附量，結果見圖1。

圖1 不同型號大孔樹脂動態(tài)吸附量的比較Fig.1 Comparison of dynamic adsorption capacity for different macroporous resins

由圖1可以看出，大孔樹脂HZ816具有最佳吸附性能，動態(tài)吸附量達到62mg·mL－1。因此，選擇大孔樹脂HZ816作為阿維菌素的吸附載體。

2.2 吸附流速的選擇

不同吸附流速下HZ816樹脂的阿維菌素吸附率見圖2。

圖2 上樣液吸附流速對HZ816樹脂吸附性能的影響Fig.2 Effect of flow rate of sample solution on adsorption performance of resin HZ816

由圖2可以看出，吸附流速越慢，HZ816樹脂的阿維菌素吸附率越高；但吸附流速過慢會延長產品的生產周期，提高生產成本。綜合考慮，選擇150～200 mL·h－1（1.5～2BV·h－1）作為吸附流速。

2.3 洗脫溶劑的選擇

采用4種不同洗脫溶劑，HZ816樹脂的解吸收率見圖3。

由圖3可以看出，乙醇具有較好的解吸能力。因此選擇乙醇作為洗脫溶劑。

2.4 乙醇體積分數(shù)的選擇

用不同體積分數(shù)乙醇洗脫時，阿維菌素解吸收率和B1a含量見表1 。

圖3 不同洗脫溶劑的HZ816樹脂解吸收率Fig.3 The desorption yield of resin HZ816with different eluents

表1 不同體積分數(shù)乙醇洗脫對阿維菌素解吸收率和B1a含量的影響Tab.1 Effect of different volume fractions of ethanol on yield and B1acontent of avermectin

由表1 可以看出，乙醇體積分數(shù)大于90%時，解吸收率較高，但由于阿維菌素洗脫過快，色譜峰與雜質峰不能有效分離；當乙醇體積分數(shù)小于90%時，雖然B1a含量較高，但解吸拖尾現(xiàn)象嚴重，洗脫體積明顯增加。因此，選擇90%乙醇為洗脫劑，阿維菌素分離效果好，洗脫速度快。

2.5 驗證實驗

選擇大孔樹脂HZ816作為吸附載體，在吸附流速為1.5～2BV·h－1、90%乙醇作為洗脫劑的條件下進行3次驗證實驗。結果表明，平均解吸收率大于90%、阿維菌素中B1a含量大于91%、總收率大于65%。表明大孔樹脂有效地摒棄了浸提液中的色素和大極性雜質，提高了解吸液的質量，而且具有較高的吸附率和解吸率，為下游結晶工序打下基礎。

3 結論

研究了大孔樹脂法分離純化阿維菌素的方法。選擇大孔樹脂HZ816作為吸附樹脂，在吸附流速為1.5～2BV·h－1、90%乙醇作為洗脫劑的優(yōu)化條件下，解吸收率大于90%、阿維菌素中B1a含量大于91%、總收率大于65%。該方法工藝簡單、分離效果好，可用于工業(yè)化生產。

[1]Burg R W，Miller B M，Baker E E，et al.Avermectins，a new family of potent anthelmintic agents：Producing organism and fermentation[J］.Antimicrob Angents Chemother，1979，15（3）：361－367.

[2]Pozo O J，Marin J M，Sancho J V，et al.Determination of abamectin and azadirachtin residues in orange samples by liquid chromatography－electrospray tandem mass spectrometry[J］.Journal of Chromatography A，2003，992（1－2）：133－140.

[3]Lasota J A，Dybas R A.Avermectins，a novel class of compounds：Implications for use in arthropod pest control[J］.Annu Rev Entomol，1991，36：91－117.

[4]呂淑君.阿維菌素的生物合成[J］.國外醫(yī)藥抗生素分冊，1997，18（2）：114－118.

[5]朱昌雄，孫東園，蔣細良.我國微生物農藥產業(yè)化標準及產業(yè)化對策建議[J］.現(xiàn)代化工，2004，24（3）：6－11.

[6]宋淵.阿維菌素的工業(yè)化生產研究[J］.精細與專用化學品，2002，10（21）：57－59.