張茂星， 張明超， 陳 鵬， 阮云澤， 朱毅勇*， 沈其榮

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)院， 江蘇南京 210095； 2海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 海南?？?571101)

硝/銨營(yíng)養(yǎng)對(duì)香蕉生長(zhǎng)及其枯萎病發(fā)生的影響

張茂星1， 張明超1， 陳 鵬1， 阮云澤2， 朱毅勇1*， 沈其榮1

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)院， 江蘇南京 210095； 2海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 海南海口 571101)

通過(guò)水培試驗(yàn)，研究了不同硝/銨配比對(duì)香蕉生長(zhǎng)及其根際尖孢鐮刀菌侵染的影響。結(jié)果表明， 1)銨硝混合營(yíng)養(yǎng)對(duì)香蕉生長(zhǎng)的效果優(yōu)于單一營(yíng)養(yǎng)，尤其是在75%硝態(tài)氮+25%銨態(tài)氮處理下香蕉生長(zhǎng)最好，葉片中氮、磷、鉀含量也最高； 2)香蕉根際pH在100%銨態(tài)氮處理時(shí)最低，隨著硝態(tài)氮比例的增加，pH逐漸上升； 3)接種尖孢鐮刀菌后，根際病原菌數(shù)量在100%銨態(tài)氮處理時(shí)最多，但是在根系細(xì)胞內(nèi)卻沒(méi)有檢測(cè)到，相反，隨著硝態(tài)氮比例的增加，雖然在根際中檢測(cè)到的病菌數(shù)量有所降低，但是在根系內(nèi)均發(fā)現(xiàn)存在病原菌。本研究結(jié)果說(shuō)明，相對(duì)于銨硝混合營(yíng)養(yǎng)，全銨營(yíng)養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致香蕉生長(zhǎng)受到一定的影響，但是卻能夠防止香蕉尖孢鐮刀菌侵染進(jìn)植物根系。由于在離體培養(yǎng)時(shí)，全銨可以抑制尖孢鐮刀菌穿透植物細(xì)胞壁的過(guò)程，因此全銨培養(yǎng)植物時(shí)，其根部質(zhì)外體及細(xì)胞中銨態(tài)氮濃度高很可能是抑制病原菌侵染的主要原因。

硝態(tài)氮/銨態(tài)氮比； 香蕉枯萎病； 尖孢鐮刀菌

香蕉(Musa.spp.)是我國(guó)南方尤其是海南出口貿(mào)易量最大的水果。香蕉枯萎病又名香蕉巴拿馬病、黃葉病[1]，其病原菌是尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusariumoxysporumf. sp.cubense)，4號(hào)侵染小種主要侵染香牙蕉(AAA)類，我國(guó)種植的巴西蕉、巴貝多、威廉姆斯品種都屬于香牙蕉類，因此香蕉種植產(chǎn)業(yè)經(jīng)常遭受重創(chuàng)。

該病原菌可通過(guò)帶病吸芽、土壤、雨水和氣流進(jìn)行傳播，蔓延迅速，而且在土壤中可長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)兼性寄生生活，一般藥劑難以根除。目前可通過(guò)誘變和芽變育種[2-3]，選育抗病品種，如寶島蕉、農(nóng)科一號(hào)等[4-5]，但抗病品種在品質(zhì)方面難以突破，無(wú)法推廣。也有研究者通過(guò)篩選生防菌來(lái)防控香蕉枯萎病[6]，或是施用改性石灰氮進(jìn)行化學(xué)消毒[7]，但是其殘留的氰胺類物質(zhì)同時(shí)也減少了有益微生物的數(shù)量。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)并證實(shí)[8]，尖孢鐮刀菌在銨態(tài)氮為單一氮源時(shí)不能穿透類似細(xì)胞壁成分的賽璐珞膜，從而影響了侵染過(guò)程。在有關(guān)機(jī)理上，Di Pietro認(rèn)為[9]，銨態(tài)氮促進(jìn)谷氨酰胺和蛋白激酶TOR的合成，從而引起轉(zhuǎn)錄因子MeaB的表達(dá)，MeaB的表達(dá)會(huì)抑制Fmk1基因的表達(dá)，是影響調(diào)控枯萎病病原菌穿透植物細(xì)胞壁的上游信號(hào)機(jī)制。

而有關(guān)栽培過(guò)程中香蕉枯萎病是否會(huì)受到氮素形態(tài)的影響，到目前為止還缺少研究。因此，從植物營(yíng)養(yǎng)的角度來(lái)驗(yàn)證氮素形態(tài)對(duì)香蕉枯萎病的影響，對(duì)于指導(dǎo)生產(chǎn)具有重要的實(shí)踐意義。在本實(shí)驗(yàn)中，我們利用不同硝/銨配比的營(yíng)養(yǎng)液對(duì)海南香蕉枯萎病病原菌在根際和根組織內(nèi)的發(fā)生及對(duì)植物本身的影響進(jìn)行了測(cè)定，為實(shí)踐中如何通過(guò)調(diào)控氮素營(yíng)養(yǎng)控制枯萎病的發(fā)生提供一定的理論指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)在海南省樂(lè)東縣尖峰鎮(zhèn)萬(wàn)鐘實(shí)業(yè)有限公司香蕉枯萎病研究所試驗(yàn)大棚中進(jìn)行。供試香蕉為海南主栽的巴西種香蕉(MusaAAACavendishCV． Baxi)。選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的香蕉沙床苗，洗去根部的基質(zhì)，用0.5%高錳酸鉀溶液消毒巴西香蕉幼苗的根系15 min，再定植于塑料桶中，塑料桶容積2.5L，經(jīng)1%高錳酸鉀溶液消毒后使用，外部套上黑色遮光的塑料袋。香蕉苗先用清水水培7d后再將長(zhǎng)勢(shì)一致、根系發(fā)育良好的幼苗放在不同濃度的硝/銨配比的營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)。營(yíng)養(yǎng)液采用霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液，略作修改，即在營(yíng)養(yǎng)液中加入不同形態(tài)的氮源，詳見(jiàn)表1。試驗(yàn)設(shè)5個(gè)處理：100%硝態(tài)氮 (100% N)；75%硝態(tài)氮+25%銨態(tài)氮(75%N+25%A)；50%硝態(tài)氮+50%銨態(tài)氮(50%N+50%A)；25%硝態(tài)氮+75%銨態(tài)氮(25%N+75%A)；100%銨態(tài)氮(100%A)。每個(gè)處理15株，每桶定植一株，重復(fù)3次。每隔3d更換一次營(yíng)養(yǎng)液，并將起始pH用H2SO4調(diào)到6.5，將香蕉苗培養(yǎng)一個(gè)月后，分別接種一定量的病原菌，每隔10 d接種一次，接種量為103cfu/g，連續(xù)3次，同時(shí)每個(gè)處理均設(shè)置對(duì)照。在接種病原菌后，廢棄營(yíng)養(yǎng)液經(jīng)過(guò)滅菌消毒處理。最后檢測(cè)各處理的侵染發(fā)病情況及香蕉生長(zhǎng)狀況。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目和方法

1.2.1 植株生理指標(biāo)的測(cè)定 株高(地面至頂部?jī)扇~葉柄交叉點(diǎn)的距離)、 莖圍(離地面5 cm處的假莖周長(zhǎng))、葉長(zhǎng)(頂部完全展開(kāi)第1片葉葉基至葉尖的距離)、葉寬(頂部完全展開(kāi)第1片葉最寬處的葉片寬度，測(cè)時(shí)與葉長(zhǎng)垂直)。第1片葉葉面積=0.75×葉長(zhǎng)×葉寬[10]。葉綠素相對(duì)含量用葉綠素(SPAD)儀測(cè)定頂部完全展開(kāi)第1片葉。

1.2.2 營(yíng)養(yǎng)液pH的測(cè)定 每次換下來(lái)的營(yíng)養(yǎng)液過(guò)濾后用pH計(jì)測(cè)定。

1.2.3 生物量的測(cè)定 收獲時(shí)將地上部和根分開(kāi)采樣，葉片用濕紗布輕輕擦拭，根用去離子水洗凈之后用吸水紙吸干，先測(cè)定鮮重，殺青(105℃，30 min)后70℃烘干至恒重。

1.2.4 植株全氮、磷、鉀含量的測(cè)定 香蕉根、莖、葉烘干樣品用濃硫酸消煮。全氮采用水楊酸-鋅粉還原法測(cè)定；全磷采用鉬銻抗比色法測(cè)定；全鉀采用火焰光度計(jì)法測(cè)定；植物全鈣、鎂采用原子吸收分光光度法測(cè)定[11]。

1.2.5 香蕉根際及根內(nèi)病原菌數(shù)量檢測(cè) 分別取各處理的香蕉植株根系，稱取2 g正常吸收根作為樣品，消毒3 min后，于研缽中加5 mL無(wú)菌水充分研磨，轉(zhuǎn)移并定容到10 mL的離心管中。另外再稱5 g根于45 mL無(wú)菌水中震蕩2h(170r/min)。涂布時(shí)取根系研磨液的原液和10-1稀釋液，根際震蕩液取10-1和10-2稀釋液涂布在K2選擇性培養(yǎng)基中計(jì)數(shù)[12]。涂布好后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，4d后測(cè)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。

表1 營(yíng)養(yǎng)液各組分濃度及硝/銨配比Table 1 The concentrations of medium components and nitrate/ammonium ratios

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

①截至2010年底，紹興市登記在冊(cè)的民營(yíng)企業(yè)為65，000家。65，000×90%=58，500。資料來(lái)源：http://epaper.shaoxing.com.cn/ttsb/html/2011-02/23/contoct_488833.htm.

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行處理， SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，單因素方差分析檢驗(yàn)處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硝/銨配比對(duì)香蕉生物量的影響

從圖1可以看出，香蕉在不同硝/銨配比營(yíng)養(yǎng)液中處理30d后，其地下部根系的鮮重差異不顯著。香蕉地上部分在75%N+25%A處理下長(zhǎng)勢(shì)最好，鮮重最大，差異極顯著。而香蕉在100% A和25%N+75%A處理下長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較差，干重的結(jié)果基本上與鮮重的結(jié)果一致，但從根干重可以進(jìn)一步反映出，其變化趨勢(shì)與地上部分是一致的，這可能是根部含水量較多，因此從鮮重上還不能明顯地反映出不同硝/銨配比對(duì)其生長(zhǎng)的影響。

圖1 不同硝/銨配比對(duì)香蕉生物量的影響Fig.1 The effect of different nitrate/ammonium ratios on banana biomass [注(Note): 柱上不同字母表示處理間差異達(dá)5%的顯著水平Different letters above the bars mean significant difference at the 5% level.]

2.2 不同硝/銨配比對(duì)香蕉形態(tài)指標(biāo)的影響

從圖2可以看出，不同硝/銨配比對(duì)香蕉植株的表型存在一定的影響，其中香蕉植株在75%N+25%A處理中株高和莖圍及葉面積均比其它各處理高，且差異極顯著。不同硝/銨配比也顯著影響香蕉葉片的葉綠素相對(duì)含量，其中香蕉在100%N處理下葉綠素含量最小，可能是由于香蕉在全部供給硝態(tài)氮的條件下根際pH環(huán)境變化使?fàn)I養(yǎng)液中Fe、Mg等養(yǎng)分的有效性降低，從而影響葉綠素的合成。而香蕉在100%A處理下植株長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)最差，株高、葉面積均比硝/銨混合營(yíng)養(yǎng)的要小，葉綠素相對(duì)含量也偏低。

圖2 不同硝/銨配比對(duì)香蕉形態(tài)指標(biāo)的影響Fig.2 The effect of different nitrate/ammonium ratios on banana morphological parameter [注(Note): 柱上不同字母表示處理間差異達(dá)5%的顯著水平Different letters above the bars mean significant difference at the 5% level.]

2.3 不同硝/銨配比對(duì)香蕉葉片養(yǎng)分含量的影響

不同硝/銨配比影響香蕉對(duì)各種養(yǎng)分的吸收，從表2可以看出，香蕉葉片中的氮、磷、鉀含量在75%N+25%A處理中最高，

與其他處理差異顯著。而 表2 不同硝/銨配比對(duì)香蕉葉片養(yǎng)分含量的影響(g/kg)Table 2 The effect of different nitrate/ammonium ratios on banana leaf nutrition concentration.

注(Note): 同列數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間差異達(dá)5%的顯著水平 Values followed by different letters in the same column mean significant difference at the 5% level.

香蕉葉片中的鈣、鎂在100%N處理中含量最高，也與其他處理的差異達(dá)到顯著水平，而在不同硝/銨比例的處理中差異不明顯。本結(jié)果也說(shuō)明植物根系吸收養(yǎng)分過(guò)程是一個(gè)陰陽(yáng)離子平衡的動(dòng)態(tài)過(guò)程，因此吸收硝態(tài)氮過(guò)程中其他幾種陽(yáng)離子如鉀、鈣、鎂的吸收均會(huì)增加，相反在吸收銨態(tài)氮的過(guò)程中會(huì)影響這些陽(yáng)離子的吸收[13-14]。

2.4 不同硝/銨配比對(duì)香蕉根際pH的影響

2.5不同硝/銨配比對(duì)香蕉根際尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響

圖3 不同硝/銨配比對(duì)香蕉根際pH的影響Fig.3 The effect of different nitrate/ammonium ratios on banana rhizosphere pH [注(Note): 柱上不同字母表示處理間差異達(dá)5%的顯著水平 Different letters above the bars mean significant difference at the 5% level.]

圖4顯示，香蕉根際病原菌數(shù)量在100%銨態(tài)氮時(shí)最多，為2.4×103cfu/g。而不同硝/銨配比處理的香蕉根際尖孢鐮刀菌數(shù)量差異不明顯，并且100%硝態(tài)氮處理的根際病原菌的數(shù)量最少。然而從表3的結(jié)果來(lái)看，香蕉根系經(jīng)過(guò)表面消毒處理后，100%A處理的根系組織中并沒(méi)有檢測(cè)到尖孢鐮刀菌，而只要是硝態(tài)氮的處理，無(wú)論比例大小，根系組織中都檢測(cè)到病原菌的存在，這說(shuō)明香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌在銨態(tài)氮作為單一氮源的條件下不能穿透根系細(xì)胞壁進(jìn)入根系組織。

圖4 不同銨硝配比對(duì)香蕉根際尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響Fig.4 The effect of different ammonium/nitrate ratios on banana rhizosphere Fusarium Oxysporum quantity [注(Note): 柱上不同字母表示處理間差異達(dá)5%的顯著水平 Different letters above the bars mean significant difference at the 5% level.]

表3 不同銨硝配比對(duì)香蕉根研磨液尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響(cfu/g)Table 3 The effect of different ammonium/nitrate ratios on banana root grinding fluid Fusarium Oxysporum quantity

3 討論與結(jié)論

雖然一般的植物都能吸收硝、銨兩種形態(tài)的氮源，但是大多數(shù)旱地植物在單一的銨態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下很容易出現(xiàn)銨中毒的現(xiàn)象[18]。雖然本實(shí)驗(yàn)中香蕉沒(méi)有出現(xiàn)銨中毒現(xiàn)象，但是也明顯受到了一定程度的抑制。從本試驗(yàn)測(cè)定的數(shù)據(jù)可以看出，香蕉的鮮重、株高、莖圍、葉面積均隨著銨態(tài)氮濃度的增加而有所降低(圖1、圖2)。由于植物吸收銨態(tài)氮造成根際酸化[19]，本試驗(yàn)中100%銨態(tài)氮處理3 d后，營(yíng)養(yǎng)液pH從6.5降低到4.8(圖3)。一般認(rèn)為細(xì)胞外H+濃度增加會(huì)對(duì)細(xì)胞膜質(zhì)子泵產(chǎn)生抑制[20]。而質(zhì)子泵活性下降會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，影響根系對(duì)其他養(yǎng)分離子的吸收，進(jìn)而造成植物生長(zhǎng)受阻。另外，由于銨態(tài)氮是陽(yáng)離子，并且其吸收量很大，因此也會(huì)導(dǎo)致其他陽(yáng)離子的吸收受到影響，這在本試驗(yàn)中也得到驗(yàn)證(表2)，主要是鈣、鎂、鉀離子的吸收明顯減少。這些都可能是導(dǎo)致全銨營(yíng)養(yǎng)下植物生長(zhǎng)受到一定抑制的原因。

而硝態(tài)氮不僅是營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)也是調(diào)控植物初級(jí)代謝的一種信號(hào)分子，因此當(dāng)作物缺少硝態(tài)氮時(shí)生長(zhǎng)也容易受到抑制[21-22]。相反，增加硝態(tài)氮能夠減輕或避免銨中毒[23]，并且改善由于植物吸收銨態(tài)氮導(dǎo)致的根際酸化問(wèn)題[24]。由此可見(jiàn)，在硝、銨混合營(yíng)養(yǎng)條件下植物生長(zhǎng)比單一氮源更好，本試驗(yàn)結(jié)果也證明了這一點(diǎn)(圖1、 2)。

另外，在本試驗(yàn)中，由于使用的是NH4Cl，因此當(dāng)銨態(tài)氮濃度提高時(shí)也意味著氯離子的濃度也在增加，從已有的文獻(xiàn)中也發(fā)現(xiàn)[28]，二氧化氯對(duì)枯萎菌也有一定的抑制作用，因此也不能排除氯離子抑制香蕉枯萎病的作用，這方面也需要進(jìn)一步的研究進(jìn)行證實(shí)。

綜上所述，銨態(tài)氮在一定程度上可以有效地控制香蕉尖孢鐮刀菌的侵染過(guò)程，在實(shí)踐中可以通過(guò)增加銨的濃度來(lái)控制香蕉枯萎病的發(fā)生，并施加一定量的硝態(tài)氮肥以減緩植物銨中毒，這方面也需要通過(guò)大田試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，這也是我們今后研究的一個(gè)方向。

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Influenceofnitrate/ammoniumratioontheplantgrowthofbananaandrelatedwiltdiseasedevelopment

ZHANG Mao-xing1, ZHANG Ming-chao1, CHEN Peng1, RUAN Yun-ze2, ZHU Yi-yong1*, SHEN Qi-rong1

(1CollegeofResourceandEnvironmentScience,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China;2CollegeofAgronomy,HainanUniversity,Haikou571101,China)

Hydroponics experiments were conducted to investigate the effects of nitrate/ammonium ratio on the growth of banana plants and invasion of bananaFusariumoxysporumf. sp.Cubense. The results showed that, 1) In comparison with the treatments of sole nitrogen source, under the treatment of 75% nitrate + 25% ammonium (75% N + 25% A), the biomass of banana plants and the content of N, P, K in plants were the highest amongst all the treatments. 2) The rhizospheric pH was decreased strongly under the 100% ammonium treatment, while the pH increased with the addition of nitrate in the root medium. 3) After inoculation ofFusariumoxysporumf. sp.Cubense, the population of pathogen in rhizosphere was increased by the application of ammonium nutrition, but the number of pathogen in root tissue was reduced especially when the ammonium ratio reached 100%, no pathogen was detected in the root. In conclusion, sole ammonium nutrition could depress the growth of banana plants, but it can inhibitFusariumoxysporumf. sp.Cubensepenetration into the root cells. In combination with our previous experiments in vitro, that 100% ammonium inhibitedFusariumoxysporumf. sp.Cubensepenetration process through the host plant cell wall. Our results suggested that the high concentration of ammonium in root cytoplast and cytosol could play an important role in the inhibition of invasion of this pathogen.

nitrate/ammonium ratio; banana wilt disease;Fusariumoxysporumf. sp.Cubense

2013-01-11接受日期2013-05-07

教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(NCET-11-0672)；國(guó)家自然科學(xué)基金(41101231)；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201103004)資助。

張茂星(1988—)，男，江西吉安人，碩士研究生，主要從事植物營(yíng)養(yǎng)與病理方面的研究。E-mail: 2011103170@njau.edu.cn * 通信作者 E-mail: yiyong1973@njau.edu.cn

S668.1； S432

A

1008-505X(2013)05-1241-07