徐雪梅，王巧民，宋繼中，代子艷

1.安徽省立醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 合肥 230001;2.阜陽(yáng)市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科

諸多研究包括流行病學(xué)、臨床試驗(yàn)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都證明了感染對(duì)腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)的發(fā)生發(fā)展有重大影響，但其確切機(jī)制還不明確。由于在IBS患者中不易獲取腸組織，取材的深度和大小均受到局限，并且涉及到人體實(shí)驗(yàn)的倫理學(xué)問(wèn)題，建造模擬IBS發(fā)病的動(dòng)物模型進(jìn)行研究無(wú)疑十分重要。目前有關(guān)腸道感染和IBS關(guān)系的研究在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，國(guó)內(nèi)外都有了一定的研究。但是用于實(shí)驗(yàn)的病原體多數(shù)是旋毛蟲(chóng)、線蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)，用細(xì)菌進(jìn)行研究的較少，而實(shí)際上與感染后腸易激綜合征(postinfectious irritable bowel syndrome，PI-IBS)有關(guān)的病原體多是細(xì)菌。當(dāng)前用細(xì)菌制造PI-IBS動(dòng)物模型的方法國(guó)內(nèi)外比較成功的還很少見(jiàn)[1-2]。因此制造PI-IBS腸道細(xì)菌感染的動(dòng)物模型很有必要性且具有可行性。本研究目的:用福氏志賀菌感染大鼠，制作感染后大鼠腸功能紊亂模型，以腸道急性感染消失，即病原學(xué)培養(yǎng)無(wú)致病菌生長(zhǎng)，病理組織學(xué)顯示結(jié)腸組織無(wú)固有層中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)和間質(zhì)水腫;出現(xiàn)內(nèi)臟高敏感性伴有或不伴有腸道運(yùn)動(dòng)功能異常，作為感染后腸功能紊亂動(dòng)物模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)[1-5]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 由武漢疾病控制中心提供wista大鼠，飼養(yǎng)條件Ⅱ級(jí)，雄性，體質(zhì)量180～210 g。稱重編號(hào)后隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。

1.2 細(xì)菌 福氏4型志賀菌由安徽醫(yī)科大學(xué)微生物教研室提供。

1.3 腸功能紊亂大鼠模型的建立 大鼠被隨機(jī)分為感染組和對(duì)照組，每組20只。感染組予2 mL的5×109cfu/mL福氏志賀菌灌胃，對(duì)照組予2 mL的生理鹽水灌胃。灌胃后每天觀察大鼠的排便情況，并后于灌胃后第1天、第3天、第14天、第21天進(jìn)行大便培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)2次及以上陰性的繼續(xù)下面的實(shí)驗(yàn)，否則撤出實(shí)驗(yàn)。內(nèi)臟敏感性的測(cè)定于灌胃后的第21天、42天、63天進(jìn)行。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將大鼠全部處死，取回腸和結(jié)腸標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)檢查，觀察腸道的炎癥情況。

1.4 模型成功的判斷方法 (1)大鼠大便性狀觀察:灌胃后每天觀察大鼠的排便情況。大便性狀采用Bristol分級(jí)[6]。其中1～2級(jí)表示便秘，3～4級(jí)表示正常，5～7級(jí)表示有腹瀉。按照分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分別將1～7級(jí)賦值為1～7分，對(duì)大鼠大便性狀進(jìn)行評(píng)分。(2)大便4型福氏志賀菌培養(yǎng)情況:于灌胃后第1、3、14、21天行大便培養(yǎng)，培養(yǎng)方法:取大鼠大便適量，性狀改變者取黏液、膿血部分，接種于SS培養(yǎng)板，37℃溫箱內(nèi)培育18～24 h，挑取無(wú)色半透明可疑菌落，作生化反應(yīng)，如果葡萄糖反應(yīng)(+)，乳糖反應(yīng)(－)，蔗糖反應(yīng)(－)，種半固體顯示動(dòng)力(－)，初步鑒定結(jié)果為福氏痢疾桿菌，再進(jìn)行血清學(xué)鑒定，即福氏4型血清凝集，證明大便培養(yǎng)福氏4型志賀氏痢疾桿菌培養(yǎng)(+)，否則為志賀氏痢疾桿菌培養(yǎng)(－)。連續(xù)2次或2次以上陰性繼續(xù)下面的實(shí)驗(yàn)。(3)內(nèi)臟敏感性測(cè)定:在灌胃造模后第21天、42天、63天，采用直腸球囊擴(kuò)張(colorectal distension，CRD)的方法觀察大鼠腹部回撤反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)。實(shí)驗(yàn)前，禁食不禁水24 h，以減少糞便形成，并于實(shí)驗(yàn)前輕觸肛門(mén)，使其排除殘余糞便。將Braun10F導(dǎo)尿管石蠟油潤(rùn)滑后，插入直腸，使氣囊尾端距肛門(mén)1 cm，用4號(hào)手術(shù)線固定于鼠尾根部，將大鼠放入透明的鼠固定器內(nèi)，使其四肢不能活動(dòng)，但是能觀察其腹部回撤反射。大約30 min后，大鼠適應(yīng)環(huán)境后開(kāi)始注入常溫(26～28℃)生理鹽水，從0.1 mL開(kāi)始，以每次0.1 mL的梯度遞增，使球囊內(nèi)壓力逐漸升高。分別觀察引起大鼠腹部抬起以及背部拱起的容量閾值，進(jìn)行評(píng)估。每次間隔30 min，重復(fù)進(jìn)行3次擴(kuò)張，取均值。采用直腸擴(kuò)張時(shí)AWR[7]評(píng)分。記錄引起評(píng)分為3分和4分時(shí)兩個(gè)行為學(xué)反應(yīng)的最小容量閾值。(4)組織形態(tài)學(xué):水合氯醛麻醉大鼠，剖腹手術(shù)分離末端回腸(距回盲部5 cm)和近端結(jié)腸(回盲部下3 cm)，用鹽水沖洗。所有標(biāo)本組織經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色，染色結(jié)果均由兩位病理醫(yī)師閱片診斷核實(shí)，觀察腸黏膜固有層有無(wú)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及間質(zhì)有無(wú)水腫。具體評(píng)分如下:輕度:固有層少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，輕度或無(wú)間質(zhì)水腫;中度:固有層中等量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)中度水腫;重度:中量到大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)固有層，嚴(yán)重間質(zhì)水腫。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大便培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)組大鼠于急性感染后第1天，大便4型福氏志賀菌培養(yǎng)結(jié)果陽(yáng)性，第3天有16只大鼠培養(yǎng)陽(yáng)性，至第14天及第21天，大便致病菌培養(yǎng)均為陰性，至實(shí)驗(yàn)即將結(jié)束時(shí)的最后一次培養(yǎng)亦為陰性。正常對(duì)照組大鼠大便致病菌培養(yǎng)始終陰性。

2.2 大便性狀的觀察 對(duì)照組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間大便性狀無(wú)明顯改變。感染組在灌胃后第1～2天開(kāi)始出現(xiàn)糞質(zhì)稀薄，少數(shù)伴有黏液便，第3～4天癥狀最為明顯，Bristol分級(jí)評(píng)分為5.20 ±0.42，對(duì)照組分級(jí)評(píng)分為3.6±0.52，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，第7天癥狀減輕，所有大鼠第10天癥狀基本消失。在第21天進(jìn)行第一次內(nèi)臟敏感性測(cè)定后，感染組大鼠再次出現(xiàn)糞便形狀不規(guī)則伴有黏液，此后有18只大鼠一直間斷有黏液便直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，另外2只大鼠很快大便又恢復(fù)正常。

2.3 腸道感染對(duì)大鼠內(nèi)臟感覺(jué)功能的影響 在感染后的第21天、42天、63天，大鼠腹部抬起(AWR評(píng)分3分)，弓背(AWR評(píng)分為4分)的容量閾值較對(duì)照組均明顯降低(P＜0.05)(見(jiàn)表1和表2)。然而將感染組大鼠在上述3天內(nèi)腹部抬起和弓背的最小容量閾值進(jìn)行比較，差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。

表1 AWR評(píng)分為3分時(shí)的容量閾值比較(，mL)Tab1 Comparison of the threshold at 3 points of the AWR(，mL)

表1 AWR評(píng)分為3分時(shí)的容量閾值比較(，mL)Tab1 Comparison of the threshold at 3 points of the AWR(，mL)

分組 第21天 第42天 第63天感染組2.26 ±0.17 2.28 ±0.18 2.23 ±0.211.04 ±0.24 1.07 ±0.19 1.12 ±0.15對(duì)照組

表2 AWR評(píng)分為4分時(shí)的容量閾值比較(，mL)Tab2 Comparison of the threshold at 4 points of the AWR(，mL)

表2 AWR評(píng)分為4分時(shí)的容量閾值比較(，mL)Tab2 Comparison of the threshold at 4 points of the AWR(，mL)

分組 第21天 第42天 第63天

2.3 組織學(xué)檢查 HE染色兩組大鼠末端回腸和近端結(jié)腸未見(jiàn)明顯組織損傷，切片顯示未見(jiàn)明顯中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)無(wú)明顯水腫，屬于輕度。

3 討論

當(dāng)前模擬PI-IBS發(fā)病的動(dòng)物模型多是以炎性介質(zhì)或是寄生蟲(chóng)感染作為誘發(fā)因素，而臨床上PI-IBS的發(fā)病多是在細(xì)菌感染后，而且在我國(guó)急性胃腸炎的病原體以痢疾桿菌中的福氏志賀菌最為多見(jiàn)，目前國(guó)內(nèi)僅有個(gè)別報(bào)道福氏志賀菌感染比較成功的大鼠模型[1]，因此進(jìn)一步研究4型福氏志賀菌作為致病菌來(lái)誘導(dǎo)PI-IBS動(dòng)物模型，并研究其發(fā)病機(jī)制很有必要。

采用4型福氏志賀菌造模，在造模中采用的是2 mL 5×109cfu/mL給大鼠進(jìn)行灌胃，與國(guó)內(nèi)研究[2]中細(xì)菌菌量不同，我們考慮與細(xì)菌在不同培養(yǎng)環(huán)境下的毒力不同有關(guān)，比如在普通培養(yǎng)基中細(xì)菌的毒力會(huì)低于肉湯培養(yǎng)基中的毒力，而我們采用的細(xì)菌是在普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的。在實(shí)驗(yàn)中我們采用給對(duì)照組大鼠灌入同等量的生理鹽水作為對(duì)照，感染組大鼠在灌胃后第1～2天后出現(xiàn)大便性狀改變，并且大便培養(yǎng)致病菌陽(yáng)性，而對(duì)照組大便正常，大便培養(yǎng)陰性，說(shuō)明感染成功。

由于IBS的診斷是基于癥狀的診斷，缺乏生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，因此造成動(dòng)物模型評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法統(tǒng)一，現(xiàn)有的動(dòng)物模型還不能將IBS同其他的功能性疾病進(jìn)行區(qū)分。因此，目前還沒(méi)有理想的研究IBS的動(dòng)物模型。早先的研究認(rèn)為對(duì)腸腔擴(kuò)張刺激的敏感性增加是IBS患者的共同特征之一[8-9]。內(nèi)臟高敏感性被認(rèn)為是IBS的基本特征[10]。因此，當(dāng)前關(guān)于IBS的動(dòng)物模型多以內(nèi)臟敏感性增加作為IBS動(dòng)物模型成功的標(biāo)志。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中測(cè)定大鼠內(nèi)臟敏感性的方法是采用了應(yīng)用最為廣泛的即通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行CRD，觀察大鼠AWR的方法，每次刺激間隔30 min，重復(fù)3次進(jìn)行。我們選用了AWR評(píng)分中改變最客觀也最易觀察的兩個(gè)大鼠行為學(xué)反應(yīng)，即腹部抬離桌面和弓背，由非實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行AWR評(píng)分，最大限度地減少主觀原因造成的偏差。之所以選擇感染后第21天開(kāi)始進(jìn)行內(nèi)臟敏感性的測(cè)定，是因?yàn)槲墨I(xiàn)記載感染后急性炎癥消失一般在第3～4周左右[1-5]。此后我們每隔3周重復(fù)進(jìn)行內(nèi)臟敏感性的測(cè)定，是為了觀察其內(nèi)臟敏感性是否持續(xù)增高。

本實(shí)驗(yàn)中用福氏志賀菌感染大鼠后，在急性期大鼠出現(xiàn)大便性狀的改變，并且經(jīng)大便培養(yǎng)確定感染成功，此后連續(xù)2次培養(yǎng)陰性后，大鼠仍有反復(fù)持續(xù)的大便性狀改變，伴有內(nèi)臟敏感性持續(xù)而顯著的增高，病理切片顯示在末端回腸及近端結(jié)腸均無(wú)明顯中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及間質(zhì)水腫，說(shuō)明感染后大鼠腸功能紊亂模型成功。并且大鼠大便性狀改變和內(nèi)臟敏感性增加持續(xù)到感染后9周，說(shuō)明感染后大鼠具有感覺(jué)和動(dòng)力的雙重障礙，更加符合腸功能紊亂慢性復(fù)發(fā)性的特點(diǎn)，更貼近于IBS的臨床特點(diǎn)。

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