祖 靚，朱 榮

大自噬（統(tǒng)稱“細(xì)胞自噬”）是從酵母菌到人類在進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞內(nèi)分解代謝過程。長壽蛋白質(zhì)或衰老、損傷的細(xì)胞器被自噬小體包裹后轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體降解，部分產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成物質(zhì)代謝和能量代謝循環(huán)的底物，可以滿足細(xì)胞在饑餓等應(yīng)激狀態(tài)下的能量需求。骨骼肌大約占體重的40%，是哺乳動物主要的蛋白質(zhì)儲存庫，在能量耗竭時是氨基酸的主要來源，同時還是機(jī)體主要的動力器官。多項研究表明，維持骨骼肌的完整性需要適宜的自噬水平。過高或過低的自噬都不利于骨骼肌的健康，自噬過高引起骨骼肌質(zhì)量下降，自噬過低又引起骨骼肌纖維降解和肌無力［24］。在敲除自噬基因ATG 7的小鼠骨骼肌中觀察到肌肉萎縮和肌力下降［18］。在自然衰老的動物骨骼肌中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬關(guān)鍵蛋白LC3-II、p62表達(dá)增高，去神經(jīng)支配的年輕動物中自噬蛋白表達(dá)也顯著增加［21］。自噬缺陷還會降低小鼠的運(yùn)動耐力，引起糖代謝異常［11］。以上研究均表明，細(xì)胞自噬在維持骨骼肌內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中的作用至關(guān)重要。2012年Garber［7］在Science雜志上指出，運(yùn)動訓(xùn)練對機(jī)體代謝的良性效應(yīng)可利用自噬現(xiàn)象來解釋，使細(xì)胞自噬成為運(yùn)動科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。然而，運(yùn)動訓(xùn)練對骨骼肌內(nèi)細(xì)胞自噬影響的研究剛剛起步，調(diào)節(jié)機(jī)制也未完全明確。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是真核細(xì)胞內(nèi)重要的能量感受器，對ATP／AMP變化非常敏感，被譽(yù)為能量平衡的中心調(diào)節(jié)因子。體外實驗發(fā)現(xiàn)，HEK293細(xì)胞在葡萄糖缺乏時，AMPK可以直接與自噬啟動早期階段具有重要作用的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶——失調(diào)51樣激酶-1（uncoordinated 51like kinase-1，ULK1）結(jié)合，并磷酸化ULK1Ser317和Ser777位點，提高ULK1酶活性，促進(jìn)細(xì)胞自噬［15］。本文擬觀察力竭跑臺運(yùn)動對小鼠骨骼肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，并試圖研究AMPK在活體骨骼肌細(xì)胞自噬中的作用和機(jī)制。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗對象

清潔級健康雄性C57BL／6小鼠96只，2月齡，體質(zhì)量19.5±1.4g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，自由進(jìn)食水，飼養(yǎng)環(huán)境為20～25℃，濕度45%～60%，12h／12h晝夜節(jié)律光照。

1.2 實驗分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)體重隨機(jī)將96只小鼠分為AICAR注射組（AICAR Injection，AI）、力竭運(yùn)動組（Exhaustive Exercise，EE）、Compound C 注射＋力竭運(yùn)動組（Compound C＋Exhaustive Exercise，CE）和相應(yīng)的安靜對照組（Sedentary Control，SC）。根據(jù)取材時間，AI組又分注射后1h，2h和6h組。EE，CE組分別分為運(yùn)動后即刻和注射后即刻、3h、6h、12h和24h組，加上各自對照組總共16組，每組6只。SC組籠中常規(guī)飼養(yǎng)，不進(jìn)行訓(xùn)練；CE組及其對照組在運(yùn)動開始前20min按照0.5g／kg體重（預(yù)實驗確定）大腿外側(cè)皮下分別注射AMPK活性抑制劑Compound C（Merk）和等劑量生理鹽水，EE組及其對照組均注射等劑量生理鹽水；AI組及其對照組分別按照0.7g／kg體重［8］皮下注射 AMPK激活劑 AICAR（Santa Cruz）和等劑量生理鹽水。

1.3 動物運(yùn)動方案及取材

在正式實驗前，運(yùn)動組小鼠先進(jìn)行2～3次適應(yīng)性跑臺練習(xí)，每次先以5m／min的強(qiáng)度進(jìn)行3min熱身運(yùn)動，然后逐漸加速至11m／min，第一次持續(xù)10min，第二次持續(xù)30min，第三次持續(xù)50min。隔天進(jìn)行正式實驗。運(yùn)動組小鼠進(jìn)行速度為11m／min（75%˙VO2max）、坡度為0°跑臺運(yùn)動［6］，直至力竭。力竭標(biāo)準(zhǔn):當(dāng)小鼠不能維持跑臺預(yù)定速度，隨轉(zhuǎn)動皮帶拖至跑臺后端的擋板（泡沫自制）處停留達(dá)30s以上，毛刷驅(qū)趕或手輕推均無效，視為力竭［19］。采用頸椎脫臼法處死小鼠，在30～60s內(nèi)采集雙側(cè)后肢腓腸肌標(biāo)本，包裹在錫紙中，液氮驟冷，轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱（Thermo）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ELISA法測定AMPK酶活性

40mg腓腸肌于蛋白裂解液中充分勻漿，12000rpm離心30min，取上清液，考馬斯亮藍(lán)法測蛋白濃度。PBS稀釋樣品至20μg／ml，根據(jù)上海藍(lán)基生物ELISA試劑盒說明書（產(chǎn)品編號:E02A0043）向96孔酶標(biāo)板上加入50μl濃度依次稀釋的樣品（最低不得低于2μg／ml）。塑料膜封板室溫孵育2h后，200μl PBS清洗酶標(biāo)板。200μl封閉液（PBS稀釋的5%脫脂牛奶）封閉，塑料膜封板4℃過夜。次日，200μl PBS清洗酶標(biāo)板兩次，每孔加入100μl一抗稀釋液，塑料膜封板室溫孵育2h。PBS清洗酶標(biāo)板，每孔加入100μl二抗（封閉液稀釋），塑料膜封板室溫孵育1.5 h。PBS清洗酶標(biāo)板，每孔加入50μl HRP發(fā)光液，5min后加入100μl反應(yīng)終止液，通過酶標(biāo)儀（Bio-rad，美國）在450nm波長下測定各孔OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)回歸方程OD＝濃度×0.133（U／L），計算出待測樣品AMPK濃度。用AMPK濃度／總蛋白濃度比值表示AMPK活性。

1.5 Western blot法測定骨骼肌相關(guān)蛋白表達(dá)

將上樣緩沖液與上述骨骼肌蛋白樣品等體積混合煮沸10min。在垂直電泳儀上用相同體積的15μg蛋白質(zhì)樣品分別經(jīng)6%、15%、10%SDS-PAGE分離p-ULK1、LC3、ATG 7、Beclin1、p62和β-tubulin后，轉(zhuǎn)移于PVDF膜上。1∶1000兔抗鼠一抗4℃靜置孵育過夜，PBS洗滌3次，再以1∶1000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（H＋L）二抗室溫孵育1h，PBS充分洗滌后，在暗室使用ECL試劑盒發(fā)光顯影，X光膠片壓片曝光。采用Champ Gel 2000凝膠系統(tǒng)分析軟件，掃描定量各條帶的相對灰度值，在與內(nèi)參比較后，以對照組條帶灰度值為100%，其它組條帶灰度值與對照組條帶灰度值的比值，即為其相對表達(dá)量（%）。

1.6 免疫共沉淀法測定AMPK和ULK1結(jié)合量

60mg新鮮腓腸肌組織，提取蛋白，并測定濃度（同上）。按照碧云天Protein A＋G Agarose（產(chǎn)品編號P2012）試劑盒說明書，向待測樣品加入1μg AMPK一抗，4℃緩慢搖動過夜（搖床置于冰箱內(nèi)）。加入25μl Protein A＋G，4℃緩慢搖動3h，捕獲蛋白復(fù)合物。2500rpm（約1000 g）離心5min，吸除上清。500μl預(yù)冷PBS洗劑沉淀5次。最后一次洗劑后去除上清，加入30μl SDS-PAGE上樣緩沖液，瞬時離心。沸水浴處理5min，樣品用8%SDSPAGE分離AMPK和ULK1。接下來的步驟同Western blot，AMPK和ULK1蛋白以積分灰度值的比值表示。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對所獲得的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)，以P＜0.01為非常顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 AICAR和力竭運(yùn)動對骨骼肌AMPK活性的影響

小鼠腓腸肌AMPK活性在AICAR注射后1h時顯著升高（P＜0.01），2h后仍顯著高于對照組（P＜0.05），但與1h組相比，下降明顯（P＜0.01），6h時基本恢復(fù)（圖1A）；力竭運(yùn)動后即刻，AMPK活性明顯升高（P＜0.01），3h時顯著下降，但仍顯著高于對照組（P＜0.05），6h時基本恢復(fù)；Compound C＋力竭運(yùn)動組，AMPK活性在運(yùn)動后與對照組相比變化不大，但在運(yùn)動后即刻顯著低于力竭運(yùn)動組（P＜0.01，圖1B）。

圖1 本研究AICAR和力竭運(yùn)動對小鼠骨骼肌AMPK活性的影響Figure 1.Effects of AICAR and Exhaustive Exercise on AMPK Activity in Murine Skeletal Muscle

2.2 AICAR對骨骼肌AMPK／ULK1的影響

如圖2所示，AMPK／ULK1結(jié)合量在AICAR注射后1 h時顯著增加（P＜0.01），2h時明顯下降（P＜0.05），6h時基本恢復(fù)到正常水平。

2.3 AICAR對骨骼肌自噬關(guān)鍵蛋白ULK1、LC3等含量的影響

如圖3、4、5所示，ULK1Ser317磷酸化水平在AICAR注射后1h時顯著高于對照組（P＜0.01），2h時基本下降到正常水平；與對照組相比，LC3-I在AICAR注射1h時顯著下降（P＜0.05），6h時基本恢復(fù)（P＜0.05）；LC3-II在AICAR注射后1h時顯著增加（P＜0.01），恢復(fù)期（2h，6h）顯著下降（P＜0.01）；LC3-II／LC3-I比值在 AICAR注射后1h時顯著升高（P＜0.01），恢復(fù)期（2h，6h）顯著下降（P＜0.01）。p62在AICAR注射后有下降趨勢，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義；Beclin1和Atg7變化趨勢基本一致:AICAR注射后1h顯著下降（P＜0.05），2h時基本恢復(fù)到正常水平。

圖2 本研究AICAR對小鼠骨骼肌AMPK／ULK1結(jié)合影響Figure 2.Effects of AICAR on Binding Activity of AMPK／ULK1in Murine Skeletal Muscle

圖3 本研究AICAR對小鼠骨骼肌ULK1Ser317磷酸化水平的影響Figure 3.Effects of AICAR on Phosphorylation of ULK1Ser317 Site in Murine Skeletal Muscle

圖4 本研究AICAR對小鼠骨骼肌LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化的影響Figure 4.Effects of AICAR on Conversion of LC3-I to LC3-II in Murine Skeletal Muscle

2.4 力竭運(yùn)動對骨骼肌AMPK／ULK1結(jié)合的影響

圖6表明，力竭運(yùn)動組AMPK／ULK1結(jié)合量在運(yùn)動后即刻顯著高于對照組（P＜0.01），3h時仍顯著高于對照組（P＜0.05），6h時基本恢復(fù)；與對照組相比，Compound C注射運(yùn)動組AMPK／ULK1結(jié)合在運(yùn)動后變化不明顯，但與力竭運(yùn)動組相比，Compound C注射＋力竭運(yùn)動組AMPK／ULK1結(jié)合在運(yùn)動后即刻顯著低于同一時間取材的力竭運(yùn)動組 （P＜0.01）。

圖5 本研究AICAR對小鼠骨骼肌Belcin1、Atg7、p62的影響Figure 5.Effects of AICAR on Beclin1，Atg7 and p62Expression in Murine Skeletal Muscle

圖6 本研究力竭運(yùn)動對小鼠骨骼肌AMPK／ULK1結(jié)合的影響Figure 6.Effects of Exhaustive Exercise on Binding Activity of AMPK／ULK1in Murine Skeletal Muscle

2.5 力竭運(yùn)動對骨骼肌自噬關(guān)鍵蛋白 ULK1、LC3、ATG7等的影響

由圖7～12可知，力竭運(yùn)動后即刻ULK1Ser317磷酸化水平顯著提高（P＜0.01），3h時仍顯著高于對照組（P＜0.01），12h時已基本恢復(fù)；Compound C注射組p-ULK1Ser317在運(yùn)動結(jié)束后與對照組相比無顯著性差異，但運(yùn)動后即刻顯著低于力竭運(yùn)動組（P＜0.05）。力竭運(yùn)動組LC3-I在運(yùn)動后即刻顯著下降（P＜0.05），6時基本恢復(fù)；LC3-II在運(yùn)動后即刻顯著升高（P＜0.01），恢復(fù)期（6h，12h，24h）顯著下降（P＜0.01），12h時基本恢復(fù)；LC3-II／LC3-1比值 變化趨 勢同 LC3-II；Compound C注射組LC3-I在運(yùn)動后即刻也顯著下降（P＜0.05），但顯著低于EE運(yùn)動后即刻組（P＜0.05），3h時基本恢復(fù)，LC3-II在運(yùn)動后即刻顯著升高（P＜0.01），但低于EE運(yùn)動后即刻組，恢復(fù)期（6h，12h，24h）顯著下降，LC3-II／LC3-I比值變化趨勢同LC3-II；Beclin1在力竭運(yùn)動后即刻顯著低于對照組（P＜0.01），6h時已基本恢復(fù)，Compound C注射組Belcin1運(yùn)動后即刻顯著下降，但顯著高于力竭運(yùn)動后即刻組，3h時基本恢復(fù)；力竭運(yùn)動組ATG7在運(yùn)動后恢復(fù)期一直低于對照組，12h時尚未恢復(fù)，Compound C注射組ATG7在運(yùn)動后恢復(fù)期顯著低于對照組（P＜0.05）；p62在運(yùn)動后即刻顯著下降（P＜0.05），3h時已經(jīng)基本恢復(fù)，Compound C注射組p62運(yùn)動后即刻顯著增加（P＜0.01），恢復(fù)期顯著下降。

圖7 本研究力竭運(yùn)動對小鼠骨骼肌p-ULK1含量的影響Figure 7.Effects of Exhaustive Exercise on p-ULK1Level in Murine Skeletal Muscle

圖9 本研究力竭運(yùn)動對小鼠骨骼肌LC3-II／LC3-I比值的影響Figure 9.Effects of Exhaustive Exercise on Ratio of LC3-II／LC3-I in Murine Skeletal Muscle

圖10 本研究力竭運(yùn)動對小鼠骨骼肌Beclin1含量的影響Figure 10.Effects of Exhaustive Exercise on Beclin1Expression in Murine Skeletal Muscle

圖11 本研究力竭運(yùn)動對小鼠骨骼肌Atg7含量的影響Figure 11.Effects of Exhaustive Exercise on Atg7Expression in Murine Skeletal Muscle

圖12 本研究力竭運(yùn)動對小鼠骨骼肌p62含量的影響Figure 12.Effects of Exhaustive Exercise on p62Expression in Murine Skeletal Muscle

3 討論

3.1 AICAR對骨骼肌細(xì)胞自噬的影響

自噬是真核生物體內(nèi)廣泛存在的應(yīng)激應(yīng)答機(jī)制［1］，但骨骼肌內(nèi)自噬上游調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。早期研究表明，ULK1是啟動細(xì)胞自噬的重要調(diào)節(jié)因子。ULK1活性主要受磷酸化和去磷酸化修飾調(diào)控，目前已經(jīng)確定了至少30個ULK1磷酸化位點［17］，其中，mTOR和AMPK是目前已經(jīng)證實的兩個ULK1調(diào)節(jié)激酶。基礎(chǔ)狀態(tài)下，mTOR通過與ULK1結(jié)合磷酸化ULK1及其結(jié)合蛋白Atg13，降低Atg13和ULK1之間親和力，抑制ULK1酶活性，抑制自噬［13］。饑餓狀態(tài)下，AMPK成為促進(jìn)自噬的主要調(diào)節(jié)因子。在AICAR處理的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 （Mouse Embryonic Fibroblast）中，Lee 等［17］發(fā) 現(xiàn)，AMPK磷酸化mTOR結(jié)合蛋白—Raptor，抑制mTORC1復(fù)合物活性，解除其自噬抑制效應(yīng)，啟動自噬。該研究還發(fā)現(xiàn)，AMPK與ULK1蛋白脯氨酸-絲氨酸富集結(jié)構(gòu)域（proline-serine rich domain，PS）內(nèi)的654-838氨基酸序列結(jié)合對ULK1介導(dǎo)的自噬激活是不可或缺的。Sanchez等［23］在C2C12成肌細(xì)胞和C2C12肌管中也發(fā)現(xiàn)AICAR處理后AMPK與ULK1結(jié)合顯著增多，GFP-LC3標(biāo)記的自噬小體數(shù)量增多。AMPK與ULK1的結(jié)合引起何種生理效應(yīng)尚不清楚。Kim等［15］發(fā)現(xiàn)，葡萄糖缺乏時，ULK1激酶活性升高，主要表現(xiàn)為自身磷酸化水平升高，Compound C處理或者AMPKα缺失后這種變化被抑制，表明葡萄糖缺乏誘導(dǎo)的ULK1磷酸化激活是AMPK依賴性的，他們還發(fā)現(xiàn)，AMPK可以直接磷酸化ULK1Ser317和Ser777位點，促進(jìn)自噬。在體骨骼肌中是否存在AMPK對ULK1及其介導(dǎo)的自噬調(diào)控尚不清楚。

張國華等［2］通過 AICAR（0.5g／kg體重）注射觀察大鼠腓腸肌AMPK活性變化，發(fā)現(xiàn)AICAR注射1h后AMPK活性升高62%，2h時已基本恢復(fù)到正常水平。本研究發(fā)現(xiàn)，腓腸肌 AMPK活性在AICAR（0.7g／kg體重）注射后1h時顯著升高120%（P＜0.01），恢復(fù)期（2 h，6h）AMPK 活性顯著下降（P＜0.05），但是，在2h時仍顯著高于對照組（P＜0.05），可能是由于劑量不同造成的，也可能是小鼠與大鼠之間存在個體差異。骨骼肌ULK1Ser317磷酸化水平在AICAR注射后1h時顯著提高，表明AICAR在激活A(yù)MPK的同時顯著提高ULK1 Ser317磷酸化水平（P＜0.01）。同時本實驗還發(fā)現(xiàn)，AMPK與ULK1結(jié)合在AICAR注射后的變化與ULK1磷酸化水平變化趨勢基本一致，提示AMPK結(jié)合并磷酸化ULK1，提高其酶活性。

LC3蛋白翻譯后不久，就被胞漿中Atg4酶切，轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-I形式，在Atg7和Atg3作用下，LC3-I與磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）結(jié)合，下形成具有膜結(jié)合能力的LC3-II，為檢測自噬的標(biāo)志性蛋白［3］。Ge等［9］在心肌細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn) AICAR（500μM）處理50min后LC3-II表達(dá)顯著升高，LC3-II／LC3-I比值變大，但對LC3-I表達(dá)并沒有影響。本研究發(fā)現(xiàn)，AICAR注射后1h時LC3-II含量明顯增加，LC3-I下降，表明LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化增多，而LC3-II／LC3-I比值增大進(jìn)一步表明，此時AICAR顯著提高安靜狀態(tài)下骨骼肌的自噬水平，這與Ge［9］的研究結(jié)果基本一致。2h時LC3-I仍顯著低于對照組，LC3-II表達(dá)較AI1h組顯著下降（P＜0.01），LC3-II／LC3-I比例也顯著下降，表明自噬水平在AICAR注射后1h達(dá)到頂峰，2h時已呈下降趨勢，LC3-II經(jīng)自噬-溶酶體途徑降解，這也與JU等［14］研究發(fā)現(xiàn)安靜狀態(tài)下，自噬通路啟動后LC3-II水平有可能升高、下降、甚至不變的結(jié)論是一致的。本實驗首次在活體骨骼肌中驗證了AICAR注射誘導(dǎo)的AMPK激活促進(jìn)了安靜狀態(tài)下細(xì)胞自噬活化。

自噬啟動后，整個過程還有一些關(guān)鍵蛋白的參與，包括Beclin1、Atg7、p62等。Beclin1 與 PI3KIII（class III phosphatidyl-inositol 3kinase），Vps34（vacuolar protein sorting 34）形成的復(fù)合物是細(xì)胞自噬囊泡成核（vesicle nucleation）階段最重要的調(diào)節(jié)因子，與自噬小體膜的合成關(guān)系密切［4］。緊接著的囊泡伸展（vesicle elongation）階段，E1泛素樣酶Atg7在Atg12-Atg5泛素樣復(fù)合物反應(yīng)中具有重要作用，Atg7介導(dǎo)的這一反應(yīng)還能促進(jìn)PE與LC3結(jié)合以及LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化［22］。自噬的主要生理作用是降解胞漿中堆積的衰老蛋白，p62是自噬過程中底物識別的重要配體蛋白。自噬激活時，p62通過自身含有的LC3相互作用區(qū)（LC3interaction region，LIR）以配體作用方式與LC3結(jié)合，同時又通過自身泛素結(jié)合區(qū)（ubiquitin binding area，UBA）與泛素化蛋白或細(xì)胞器結(jié)合，將底物運(yùn)至自噬小體，最終進(jìn)入溶酶體途徑降解。Egan等［5］發(fā)現(xiàn)，在AMPK和ULK1基因缺乏的小鼠肝臟以及原代肝細(xì)胞中，p62堆積，線粒體自噬過程受阻，因此常常將p62作為自噬過程異常的標(biāo)志。

本研究發(fā)現(xiàn)，AICAR注射后1h游離性Beclin1蛋白含量顯著下降（P＜0.01），2h后基本恢復(fù)，可能Beclin1與其結(jié)合蛋白Vps34，PI3K等形成復(fù)合物，結(jié)合到自噬小體外膜，最終降解；Atg7在AICAR注射后1h也顯著低于對照組（P＜0.05），2h后基本恢復(fù)，盡管p62蛋白在AICAR注射后基本沒有變化，但以上結(jié)果還是足以表明，AICAR誘導(dǎo)的AMPK激活可以顯著提高骨骼肌安靜狀態(tài)下細(xì)胞自噬水平，具體機(jī)制為AMPK通過結(jié)合并磷酸化ULK1Ser317位點，提高ULK1酶活性，啟動整個細(xì)胞自噬過程。

3.2 力竭運(yùn)動誘導(dǎo)的AMPK激活對骨骼肌細(xì)胞自噬的影響

運(yùn)動可以提高細(xì)胞自噬水平，這已經(jīng)在心肌、肝臟、胰腺、脂肪和大腦皮質(zhì)等多種組織和器官中得到證實［12，20］。研究人員發(fā)現(xiàn)，長期轉(zhuǎn)輪運(yùn)動可以上調(diào)小鼠骨骼肌LC3基因表達(dá)，提高自噬水平［26］。在膠原蛋白 VI敲除（Col6a1-／-）誘發(fā)的小鼠骨骼肌肌萎縮癥中發(fā)現(xiàn)，自噬過程受損，Col6a1-／-鼠在長期轉(zhuǎn)輪運(yùn)動后，與Col6a1-／-鼠未運(yùn)動組相比，LC3-II表達(dá)顯著下降，LC3-II／LC3-I比值顯著下降，小鼠骨骼肌纖維降解以及肌肉萎縮加重，有趣的是，正常鼠骨骼肌中，運(yùn)動組LC3-II／LC3-I比值與對照組相比無顯著性差異；為了排除長期運(yùn)動引起的適應(yīng)干擾，該研究組又分析了1h遞增強(qiáng)度跑臺運(yùn)動對骨骼肌自噬的影響，發(fā)現(xiàn)LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化顯著增加，組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)自噬小體形成數(shù)目增多；而Col6a1-／-鼠在跑臺運(yùn)動后LC3脂化水平較低，與Col6a1-／-鼠未運(yùn)動組相比無顯著性差異［10］。以上實驗提示，細(xì)胞自噬參與了骨骼肌對運(yùn)動的應(yīng)答。大量研究已經(jīng)表明，運(yùn)動激活A(yù)MPK，然而運(yùn)動對ULK1影響尚未見報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動可顯著提高骨骼肌AMPK活性，ULK1Ser317磷酸化水平以及AMPK與ULK1結(jié)合量，三者變化趨勢基本一致，而且這種效應(yīng)完全被AMPK抑制劑Compound C抑制，證明ULK1Ser317磷酸化是AMPK依賴性的。Kim等［16］發(fā)現(xiàn)小鼠以12.3m／min強(qiáng)度進(jìn)行50min跑臺運(yùn)動后，LC3-II蛋白在恢復(fù)期3h、6h和12h顯著下降，同時Atg7、Beclin1同步下降。本實驗發(fā)現(xiàn)，在力竭運(yùn)動后即刻，LC3-I含量下降非常明顯（P＜0.01），LC3-II含量顯著增加，同時 LC3-II／LC3-1比值變大，表明自噬水平顯著提高；3h時自噬仍處于較高水平，此后LC3-II持續(xù)下降，LC3-II／LC3-I比值也逐漸變小，表明LC3-II已經(jīng)被降解，自噬水平下降，而LC3-I含量在6h時較運(yùn)動后3h明顯增加，LC3-II／LC3-I比值變化卻并不明顯，表明自噬水平?jīng)]有差異，提示可能是運(yùn)動誘導(dǎo)了LC3蛋白表達(dá)增多，使得LC3-I生成速度超過了LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化速度，超過了LC3-II降解速度，造成積累，隨著時間推移，自噬水平的下降LC3-II和LC3-II／LC3-I比值進(jìn)行性下降。同時游離性Atg7、Beclin1在運(yùn)動后即刻下降顯著，提示自噬過程被激活，其中Beclin1在6h時基本恢復(fù)，而Atg7在12h時才恢復(fù)。Compund C＋力竭運(yùn)動組小鼠 LC3-I、LC3-II、Beclin1、ATG7等變化趨勢同力竭運(yùn)動組，在運(yùn)動后即刻均有顯著性下降或提高，但下降或提高水平均不同程度弱于同一時刻取材的力竭組，提示除AMPK／ULK1途徑外，運(yùn)動訓(xùn)練誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬激活還受其他途徑調(diào)節(jié)，p62在Compound C注射后明顯增多，再次表明運(yùn)動誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞自噬過程受AMPK調(diào)控。

4 結(jié)論

1.AICAR誘導(dǎo)的AMPK激活顯著提高小鼠骨骼肌AMPK與ULK1的結(jié)合，提高ULK1激酶活性，提高基礎(chǔ)狀態(tài)下骨骼肌自噬水平，表明AMPK是活體骨骼肌內(nèi)細(xì)胞自噬的重要調(diào)節(jié)因子之一。

2.力竭運(yùn)動可以通過AMPK／ULK1途徑顯著提高骨骼肌細(xì)胞自噬水平，但在Compound C誘導(dǎo)的AMPK活性抑制情況下，力竭運(yùn)動仍能夠顯著提高骨骼肌細(xì)胞自噬水平，表明AMPK／ULK1并非是調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞自噬的唯一途徑，運(yùn)動應(yīng)激可能通過其它途徑提高自噬水平或ULK1活性還受其他磷酸化事件調(diào)控。

［1］錢帥偉，羅艷蕊，漆正堂，等.細(xì)胞自噬的分子學(xué)機(jī)制及運(yùn)動訓(xùn)練的調(diào)控作用［J］.體育科學(xué)，2012，32（1）:64-70.

［2］張國華.不同運(yùn)動骨骼肌AMPK的變化特點及對mTOR和下游信號的調(diào)控［D］.北京:北京體育大學(xué)博士學(xué)位論文，2008.

［3］BARTH S，GLICK D，MACLEOD K F.Autophagy:assays and artifacts［J］.J Pathol，2010，221（2）:117-124.

［4］CAO Y，KLIONSKY D J.Physiological functions of Atg6／Beclin 1:a unique autophagy-related protein［J］.Cell Res，2007，17（10）:839-849.

［5］EGAN D F，SHACKELFORD D B，MILHAYLOVA M M，et al.Phosphorylation of ULK1（hATG1）by AMP-activated protein kinase connects energy sensing to mitophagy［J］.Sci，2011，331（6016）:456-461.

［6］FERNANDO P，BONEN A，HOFFMAN-GOETZ L.Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice［J］.Can J Phys Pharmacol，1993，71（10-11）:854-857.

［7］GARBER K.Autophagy.Explaining exercise［J］.Sci，2012，335（6066）:281.

［8］GAIDHU M P，BIKOPOULOS G，CEDDIA R B.Chronic AICAR-induced AMP-kinase activation regulates adipocyte lipolysis in a time-dependent and fat depot-specific manner in rats［J］.Am J Phys Cell Phys，2012，303（11）:C1192-C1197.

［9］GE W，GUO R，REN J.AMP-dependent kinase and autophagic flux are involved in aldehyde dehydrogenase-2-induced protection against cardiac toxicity of ethanol［J］.Free Radic Biol Med，2011，51（9）:1736-1748.

［10］GRUMATI P，COLETTOO L，SCHIAVINATO A，et al.Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles［J］.Autophagy，2011，7（12）:1415-1423.

［11］HE C，BASSIK M C，MORESI V，et al.Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis［J］.Nature，2012，481（7382）:511-515.

［12］HE C，SUMPTER R J，LEVINE B.Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain［J］.Autophagy，2012，8（10）:1548-1551.

［13］HOSOKAWA N，HARA T，KAIZUKA T，et al.Nutrient-dependent mTORC1association with the ULK1-Atg13-FIP200 complex required for autophagy［J］.Mol Biol Cell，2009，20（7）:1981-1991.

［14］JU J S，VARADHACHARY A S，MILLE S E，et al.Quantitation of“autophagic flux”in mature skeletal muscle［J］.Autophagy，2010，6（7）:929-935.

［15］KIM J，KUNDU M，VIOLLET B，et al.AMPK and mTOR regulate autophagy through direct phosphorylation of ULK1［J］.Nat Cell Biol，2011，13（2）:132-141.

［16］KIM Y A，KIM YS，SONG W.Autophagic response to a single bout of moderate exercise in murine skeletal muscle［J］.J Phys Biochem，2012，68（2）:229-235.

［17］LEE J W，PARK S，TAKAHASH Y，et al.The association of AMPK with ULK1regulates autophagy［J］.PLoS One，2010，5（11）:e15394.

［18］MASIERO E，AGATEA L，MAMMUCARI C，et al.Autophagy is required to maintain muscle mass［J］.Cell Metab，2009，10（6）:507-515.

［19］MATSUIT，ISHIKAWA T，ITO H，et al.Brain glycogen supercompensation following exhaustive exercise［J］.J Phys，2012，590（Pt 3）:607-616.

［20］OGURA Y，IEMITSU M，NAITO H，et al.Single bout of running exercise changes LC3-II expression in rat cardiac muscle［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，414（4）:756-760.

［21］O＇LEARY M F，VAINSHTEIN A，IQBAL S，et al.Adaptive plasticity of autophagic proteins to denervation in aging skeletal muscle［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2013，304（5）:422-30.

［22］OTOMO C，METLAGEL Z，TAKAESU G，et al.Structure of the human ATG12～ATG5conjugate required for LC3lipidation in autophagy［J］.Nat Struct Mol Biol，2013，20（1）:59-66.

［23］SANCHEZ A M，CSIBI A，RAIBON A，et al.AMPK promotes skeletal muscle autophagy through activation of forkhead FoxO3aand interaction with Ulk1［J］.J Cell Biochem，2012，113（2）:695-710.

［24］SANDRI M.Autophagy in health and disease.3.Involvement of autophagy in muscle atrophy［J］.Am J Phys Cell Phys，2010，298（6）:C1291-C1297.

［25］WEBSTER I，F(xiàn)RIEDRICH S O，LOCHNER A，et al.AMP kinase activation and glut4translocation in isolated cardiomyocytes［J］.Cardiovasc J Afr，2010，21（2）:72-78.

［26］WOHLGEMUTH S E，SEO A Y，MARZETTI E，et al.Skeletal muscle autophagy and apoptosis during aging:effects of calorie restriction and life-long exercise［J］.Exp Gerontol，2010，45（2）:138-148.