暨南大學醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院 廣東省珠海市人民醫(yī)院（519000）陸奇凱

肺癌是環(huán)境和遺傳因素相互作用的多因素、多階段惡性腫瘤性疾病[1]。肺癌是當前癌癥死亡的主要病因之一，其死亡率增加和吸煙密切相關(guān)[2]。近年來，隨著分子生物學技術(shù)的突飛猛進和分子流行病學的發(fā)展，肺癌相關(guān)遺傳因素的研究越來越受到重視，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了可能致病的相關(guān)基因[3]。

體外實驗研究表明，GSTM1編碼缺失基因?qū)е轮掳┪镌隗w內(nèi)的代謝障礙可能是肺癌發(fā)生過程中的一個重要環(huán)節(jié)，提高了患肺癌的風險。此外，GSTM1基因可影響煙草中含有的一種亞硝胺化合物——4-甲基亞硝胺-1（3-吡啶）-丁酮所誘導(dǎo)的遺傳毒性作用及其并發(fā)的與吸煙相關(guān)的健康效應(yīng)。本研究通過對GSTM1基因多態(tài)性與環(huán)境暴露因素和肺癌易感性關(guān)系進行研究，為探索肺癌的發(fā)病機制及其診斷、防治提供理論依據(jù)。為吸煙、不良的生活習慣、職業(yè)暴露因素等可增加肺癌的罹患率提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 研究對象 肺癌病例來源于2005年9月～2011年7月期間在廣東省珠海市人民醫(yī)院經(jīng)影像學檢查，痰脫落細胞，支氣管沖洗液中找到癌細胞，外科手術(shù)切除并經(jīng)病理學確診的91例原發(fā)性肺癌患者為研究對象。按肺癌的TNM分期分類。對照組138例是來自于上述醫(yī)院的健康體檢人員。

1.2 實驗方法

1.2.1 血液標本收集 空腹采集研究對象（病例/對照）的外周靜脈血5ml，所收集的血樣立即送試驗室分離白細胞和血清，分別裝入塑料離心管中放在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆茫鍌溆?，血細胞用于提取DNA。

1.2.2 改良酚-氯仿法提取血液基因組DNA

1.2.3 采用PCR–RFLP技術(shù)檢測GSTM1基因多態(tài)性 引物設(shè)計：兩對引物（見附表1）分別特異性擴增GSTM1基因片斷（215bp）及參照基因β-globin（β-珠蛋白、268bp）。引物由上海生物工程公司合成。

反應(yīng)體系：以β球蛋白（β-Globin）為內(nèi)對照，PCR反應(yīng)體系（25μl）：Buffer 2.5μl，25mM/L的MgCl22.0μl，10mM/L的dNTPs 0.5μl，20μM/L的GSTM1引物各0.3μl，內(nèi)對照引物各0.2μl，DNA模板200ng（2μl），Taq酶1.5U（0.3μl），補雙蒸水至25μl。

反應(yīng)條件為：開始94℃預(yù)變性5min，進入熱循環(huán)94℃50s、59℃退火50s、72℃50s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

取10μl PCR產(chǎn)物于1.8%瓊脂糖凝膠水平電泳30min（電壓125V），0.5μg/ml的EB染色，ZF型紫外分析儀上觀察結(jié)果。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 計數(shù)資料使用χ2檢驗。用Logistic回歸法篩選疾病預(yù)后的有關(guān)因素，檢驗水準設(shè)為a＝0.10，其余以P＜0.05為統(tǒng)計學有意義。統(tǒng)計學分析均使用SPSS13.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 多態(tài)性結(jié)果擴增產(chǎn)物如果有215bp和268bp兩條帶，為GSTM1基因功能型，如果僅有一條268bp條帶則為GSTM1基因缺失型。

2.2 GSTM1與肺癌的關(guān)系 GSTM1基因缺失在肺癌組和對照組中的頻率分別為67.0%（61/91）和50.7%（70/138），兩組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見附表2。

2.3 吸煙、GSTM1與肺癌關(guān)系 將病例和對照分為吸煙和不吸煙兩組，在吸煙組中，GSTM1基因多態(tài)性在病例組和對照組間的差異沒有統(tǒng)計學意義；而在不吸煙組中，GSTM1基因多態(tài)性在病例組和對照組間的差異有統(tǒng)計學意義，見附表3。

2.4 肺癌類型、GSTM1與肺癌關(guān)系 將病例組分為腺癌和鱗癌兩類，發(fā)現(xiàn)肺癌病理組織學類型與GSTM1基因多態(tài)性差異無統(tǒng)計學意義，見附表4。

2.5 運用Logistic回歸評價各影響因素與肺癌的關(guān)系 在91例原發(fā)性肺癌患者中，以文化程度、吸煙、吸煙量、戒煙、開始吸煙時間、家內(nèi)吸煙者、工作環(huán)境吸煙者、家庭有無排氣扇、家庭有無抽油煙機、食動物油、常吃豆類制品、常吃蔬菜、常吃胡蘿卜、常吃水果、常吃肉類、飲酒、飲茶、體育鍛煉、有無長期精神壓抑、直系親屬癌癥史及GSTM1基因多態(tài)情況作自變量，以肺癌患病率為因變量，經(jīng)多變量logistic回歸分析，用向前法篩選變量，引入變量的檢驗水準為a＝0.10。所研究的22個相關(guān)因素中，入選模型GSTM1基因多態(tài)、吸煙、飲酒、精神調(diào)節(jié)能力、長期精神壓抑、家庭有無抽油煙機、有無直系親屬肺癌史等因素與肺癌發(fā)病有關(guān)聯(lián)，其OR值分別為：1.77、2.34、2.67、1.53、1.83、3.27、3.29，是影響肺癌患病率的危險因素。

附表1 GSTM1基因及β-globin基因擴增引物序列

附表2 GSTM1基因缺失與肺癌相對危險性分析

附表3 吸煙狀況及GSTM1基因缺失與肺癌的關(guān)系

附表4 肺癌病理組織學類型與GSTM1的關(guān)系

3 討論

谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶M1（GSTM1）是谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶超基因家族中Mu家族的成員之一，GSTMl主要催化谷光苷肽與環(huán)氧化物及多環(huán)芳烴（苯并芘）的羥基代謝產(chǎn)物等，能解毒代謝產(chǎn)物使其形成親水性物質(zhì)而排出體外[4][5]，GSTM1等位基因純合缺失，該基因型為GSTM1基因缺失型；GSTM1等位基因無缺失或雜合性缺失，該基因型為GSTM1基因功能型。若個體為GSTM1基因缺失型，則其體內(nèi)沒有GSTM1酶的表達。1990年首次報道GSTM1基因缺失與肺癌發(fā)生有密切關(guān)系后[6]。國內(nèi)外對此進行了大量研究，其結(jié)果不一。在本研究結(jié)果中，GSTM1基因缺失率在病例組和對照組的差異無統(tǒng)計學意義。

部分人存在的GSTM1缺失型是造成人群GSTM1基因多態(tài)的原因，編碼該酶的等位基因純合缺失可導(dǎo)致體內(nèi)不能產(chǎn)生有活性的酶蛋白，使得致癌物在體內(nèi)蓄積，機體的化學解毒能力下降，對癌癥的易感性增加[7][8]，尤其增加了吸煙相關(guān)性肺癌發(fā)生的危險性，并與肺鱗癌的危險性顯著增高[9]。Cabral等[10]對基因改變與肺癌易感性關(guān)系的研究結(jié)論相類似。筆者的研究將吸煙和不吸煙分為病例組和對照組，在吸煙組中，GSTM1基因缺失在兩組間的差異沒有統(tǒng)計學意義；而在不吸煙組中，GSTM1基因缺失在兩組間的差異有統(tǒng)計學意義。杜國波等[11]對川北地區(qū)125例肺癌患者和125例非肺癌患者GSTM1基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，GSTM1基因缺失型與肺癌類型無明確關(guān)系。

目前國內(nèi)外對吸煙、GSTM1、肺癌類型等相關(guān)因素與罹患肺癌危險性關(guān)系的研究結(jié)果也不一致，因此在分析GSTM1基因與肺癌的關(guān)系時，應(yīng)結(jié)合其他的環(huán)境暴露來進行才能真正揭示其在肺癌發(fā)生中的作用。

筆者所研究的22個相關(guān)因素中，入選模型GSTM1基因多態(tài)、吸煙、飲酒、精神調(diào)節(jié)能力、長期精神壓抑、家庭有無抽油煙機、有無直系親屬肺癌史等因素與肺癌發(fā)病有關(guān)聯(lián)，是影響肺癌患病率的危險因素。祝小霞[12]等報道烹調(diào)油煙暴露是非吸煙女性肺癌的危險因素，CYP1A1 MspI基因多態(tài)性與烹調(diào)油煙聯(lián)合作用可增加肺癌發(fā)病的風險，這也說明肺癌本身遺傳易感性機制十分復(fù)雜，不同種族和地區(qū)的環(huán)境暴露也是造成不同人群易感性的明顯差異的重要原因之一。因此，深入研究GSTM1基因缺失型與環(huán)境暴露因素和遺產(chǎn)易感性的交互作用在肺癌發(fā)病中的影響，發(fā)現(xiàn)并保護易感人群，對降低肺癌發(fā)病率具有重要的意義。