張書杰，雷雅靜，徐曉倩，施衛(wèi)星，陳樞青

(1.浙江大學(xué)藥學(xué)院藥理毒理與生化藥學(xué)研究所，浙江杭州310058;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，浙江杭州310058)

沙丁胺醇(salb utamol，SAL)又名咳喘寧，化學(xué)名1-(4-羥基-3-羥甲基苯基)-2-(叔丁氨基)乙醇，是一種選擇性短效β2-受體激動(dòng)劑，臨床上用于平喘藥。添加微量SAL于動(dòng)物飼料中，可以增加牲畜的瘦肉量，減少脂肪量，但其毒性遠(yuǎn)高于具有相同功能的物質(zhì)。近年來由于利益驅(qū)使，造成SAL的濫用，使得食品安全事件頻發(fā)，這嚴(yán)重威脅著人們的生命安全和健康［1］。因此，SAL殘留檢測問題一直受到人們的廣泛關(guān)注。目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于SAL殘留檢測的方法有很多，主要有HPLC、GC-MS、GC、MS-MS、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法等;其中，酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)因其快速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)已逐漸成為環(huán)境污染小分子快速檢測的主要方法之一［2］。而此類試劑盒目前主要依賴進(jìn)口，價(jià)格昂貴，因此建立快速、靈敏的ELISA檢測方法很有必要。本研究通過制備沙丁胺醇多克隆抗體，建立了間接ELISA檢測SAL濃度的方法，為開發(fā)快速、靈敏的ELISA試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 沙丁胺醇購于美國SIGMA;克倫特羅購于美國 SIGMA;沙丁胺醇人工抗原(SAL-OVA)購于珠海英平生物科技有限公司;弗氏完全佐劑CFA購于美國SIGMA;弗氏不完全佐劑IFA購于美國SIGMA;對氨基苯甲酸、亞硝酸鈉、氫氧化鈉和鹽酸均購于阿拉丁試劑;新西蘭大白兔(雄)購于浙江大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心;辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔lgG抗體購于武漢博士德生物工程有限公司;酶標(biāo)儀(BIO-RAD Model 680)購于北京成志科為生物科技公司。

1.2 溶液的配制 磷酸鹽緩沖液(PBS)、包被液、底物緩沖液、終止液、顯色液按文獻(xiàn)［3］中的方法配制。

1.3 包被原(SAL-OVA)的合成

1.3.1 重氮化法［4］合成SAL衍生物 將2.5 mmol對氨基苯甲酸溶于5 ml、5%NaOH溶液中，4℃攪拌預(yù)冷。3 mmol的NaNO2(溶于3 ml水)與7.5 mmol HCl溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%)混合后，逐滴滴加到對氨基苯甲酸溶液中，0℃～4℃反應(yīng)至KI-淀粉試紙變藍(lán)后，加少量尿素中止反應(yīng)。

將2.5 mmol的沙丁胺醇溶于1.5 ml、10%NaOH溶液中，4℃攪拌預(yù)冷，將上述得到的重氮化溶液逐滴滴加到上述溶液中，反應(yīng)30 min，得到棕黃色的渾濁液，抽濾后得到棕黃色沉淀，用1∶1的水和乙醇溶液重結(jié)晶，得到比較純的沙丁胺醇衍生物，TLC點(diǎn)板顯示含有少量的沙丁胺醇，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 SAL-OVA的合成 按照EDC/NHS法［5］，將雞卵清蛋白(OVA)與沙丁胺醇衍生物偶聯(lián)，透析完全后得到SAL-OVA。SAL-OVA溶液為淺黃色，經(jīng)紫外掃描分析證明偶聯(lián)成功，估算偶聯(lián)比為15∶1。

1.4 多克隆抗體的制備 選取2組(每組2只)體重大約2 kg的新西蘭雄性大白兔，采取背部皮下多點(diǎn)注射的方式進(jìn)行免疫。基礎(chǔ)免疫時(shí)，取一定量的 DES-HS-BSA溶液與等量的CFA(弗氏完全佐劑)混勻乳化，直至形成乳白色的油包水型乳濁液，然后進(jìn)行注射。間隔一定時(shí)間后進(jìn)行加強(qiáng)免疫(佐劑為IFA)。第2次加強(qiáng)免疫開始7 d后，取耳緣靜脈血，測血清效價(jià)，直到效價(jià)不再升高，最后一次采用頸動(dòng)脈取血，離心得到血清。

免疫劑量:一組兔子是100 μg，加強(qiáng)免疫的時(shí)間間隔為一周;另一組兔子是50 μg，加強(qiáng)免疫的時(shí)間間隔為2個(gè)月(小劑量長周期)，加強(qiáng)免疫5次［6］。比較兩組兔子抗血清的效價(jià)，取效價(jià)高、特異性好的血清，采用辛酸-硫酸銨法［7］純化，將得到的多克隆抗體加入一定比例的甘油，置-20℃保存。

1.5 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化［8-10］

1.5.1 包被緩沖液的選擇 分別以pH 9.6碳酸鹽緩沖液(CBS)、pH 7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)及蒸餾水作為包被液，每種緩沖液分別包被2塊96孔板，將包被好的板子分別于4℃過夜、37℃ 2 h包被，按照文獻(xiàn)中ELISA流程進(jìn)行操作，測定450 nm處的OD值，選擇最佳包被條件。

1.5.2 封閉液的選擇 選擇1%BSA、5%脫脂奶粉做封閉液和不加任何封閉液，進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，根據(jù)OD值選擇最佳封閉液。

1.5.3 封閉條件的選擇 4℃封閉過夜、37℃封閉1.5 h、37℃封閉45 min分別進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，選擇最佳的封閉條件。

1.5.4 酶標(biāo)二抗?jié)舛鹊倪x擇 將HRP-羊抗兔lgG 分別作 1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000 和 1∶6 000倍稀釋，ELISA測其OD值，選擇最合適的酶標(biāo)二抗?jié)舛取?/p>

1.5.5 最佳顯色時(shí)間的選擇 選擇5 min、10 min和15 min做為顯色時(shí)間，根據(jù)OD值確定最佳顯色時(shí)間。

1.6 抗原抗體最佳工作濃度的確定［11］采用棋盤法確定抗體抗原最佳工作濃度。將兔血清按照 1∶800、1∶1 600…1∶6 400…做倍比稀釋，包被原溶液稀釋為 1.5 μg/ml、1 μg/ml、0.5 μg/ml及 0 μg/ml，進(jìn)行間接 ELISA 實(shí)驗(yàn)。選擇OD值在1.0左右，空白吸收值小，抗原抗體用量最少的濃度，大致確定抗原抗體濃度，然后進(jìn)一步優(yōu)化抗原和抗體的工作濃度。以上步驟確定的最佳包被濃度作為抗原的包被濃度，用間接ELISA方法測定抗血清的效價(jià)。

1.7 抗體的特異性［12-13］將包被原抗體稀釋到最佳工作濃度，標(biāo)準(zhǔn)品(沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅、己烯雌酚、去甲腎上腺素)稀釋成1 000 ng/ml、100 ng/ml、50 ng/ml、20 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、1 ng/ml、0 ng/ml，標(biāo)準(zhǔn)品與抗血清同時(shí)加入，做間接競爭ELISA實(shí)驗(yàn)。計(jì)算抗體對小分子的IC50以及與其他小分子的交叉反應(yīng)率，交叉反應(yīng)率=IC50SAL/IC50對照×100%。

1.8 間接ELISA方法的建立［14-16］

1.8.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 稱取SAL標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，溶于1 ml甲醇溶液中制備SAL儲(chǔ)備液，放在4℃冰箱中備用。將儲(chǔ)備液稀釋成1 000 ng/ml、100 ng/ml、20 ng/ml、15 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、1 ng/ml、0.1 ng/ml及 0 ng/ml系列質(zhì)量濃度。用優(yōu)化好的間接競爭ELISA方法檢測，得到OD450，計(jì)算各質(zhì)量濃度所對應(yīng)的抑制率I=B/B0×100%(B0對應(yīng)0 ng/ml的 OD 值)，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8.2 方法的精密度 選擇3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)SAL質(zhì)量濃度(8 ng/ml、12 ng/ml和 16 ng/ml)，將每個(gè)濃度重復(fù)測定3次，計(jì)算變異系數(shù)(CV)。

1.8.3 回收率 將人尿樣在3 500 min-1條件下離心10 min，得到澄清的尿樣。取一定體積的尿樣，分別添加一定濃度的SAL標(biāo)準(zhǔn)品，使其終質(zhì)量濃度為5 ng/ml、10 ng/ml和15 ng/ml，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，用已建立的間接ELISA方法進(jìn)行回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率，回收率=實(shí)際測定的濃度/添加的濃度×100%。

1.8.4 樣本的分析 隨機(jī)抽取50個(gè)正常人的尿樣作為樣本，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)空，用已經(jīng)建立好的間接ELISA方法檢測SAL濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 包被緩沖液的選擇 棋盤法滴度結(jié)果顯示，pH 9.6的碳酸鹽緩沖液在做包被液時(shí)，陽性血清平均OD值最高，空白對照、陰性對照值最低，因此最佳包被液為pH 9.6的碳酸鹽緩沖液。

2.1.2 封閉液的選擇 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1%BSA與5%脫脂奶粉作為封閉液P/N沒有明顯的差別，但均高于不封閉的情況，由于BSA價(jià)格較貴，故選擇5%脫脂奶粉做為最佳封閉液。

2.1.3 封閉條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4℃封閉過夜與37℃封閉1.5 h結(jié)果沒有明顯差別，但37℃封閉45 min的陰性對照明顯高于另外兩種情況，考慮到ELISA快速檢測的特性，故選擇37℃封閉1.5 h作為最佳封閉條件。

2.1.4 酶標(biāo)二抗?jié)舛鹊倪x擇 HRP-羊抗兔lgG稀釋1∶5 000倍時(shí)，OD值接近1.0的數(shù)值與其他稀釋倍數(shù)相比較多，且陰性值比稀釋倍數(shù)為1∶3 000和1∶4 000時(shí)低，故選擇1∶5 000作為酶標(biāo)二抗的稀釋濃度。

2.1.5 最佳顯色時(shí)間的選擇 顯色15 min時(shí)，顏色發(fā)生改變顯色，5 min時(shí)總體OD值偏小，故選擇10 min作為最佳顯色時(shí)間。

2.2 抗原抗體最佳工作濃度的確定 棋盤法滴度結(jié)果顯示，SAL-OVA最佳包被質(zhì)量濃度為1 μg/ml，沙丁胺醇多克隆抗體最佳稀釋度為1∶25 600。

2.3 抗體的效價(jià) 以第5次免疫得到的血清作為抗血清，在優(yōu)化好的條件下測定抗體效價(jià)(圖1)，P/N值≥2.1時(shí)，抗體對應(yīng)的最高稀釋濃度為 1∶102 400，抗體的效價(jià)可達(dá) 1∶102 400。

圖1 抗血清滴度曲線Fig.1 The curve of antiserum titer

2.4 抗體的特異性 由表1可知，沙丁胺醇與鹽酸克倫特羅有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)，交叉反應(yīng)率可達(dá)97.21%，與其他相似的小分子交叉反應(yīng)率﹤0.10%。

表1 抗血清的IC50以及與其他小分子的交叉反應(yīng)率Table 1 The IC50of antiserum and the crossreactivity ratio with other small molecules

2.5 間接ELISA方法的建立

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 在優(yōu)化好的條件下，用間接ELISA法檢測SAL濃度，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，抗血清的 IC50為12.21 ng/ml，最低檢測線為2.24 ng/ml。

圖2 間接ELISA方法檢測SAL濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of SAL detected by ic-ELISA

2.5.2 方法的精密度 選擇3個(gè)SAL標(biāo)準(zhǔn)濃度(8 ng/ml、12 ng/ml、16 ng/ml)，將每個(gè)濃度反復(fù)測定3次，計(jì)算CV。SAL質(zhì)量濃度為8 ng/ml、12 ng/ml、16 ng/ml所對應(yīng)的 CV 分別為2.57、1.98、2.45，其平均 CV 為 2.33。CV ﹤3%符合方法要求的精密度。

2.5.3 回收率 用已建立的間接ELISA方法進(jìn)行回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率，SAL添加質(zhì)量濃度5 ng/ml、10 ng/ml和15 ng/ml所對應(yīng)的回收率分別為(102.62±2.30)%、(95.85±3.70)%和(98.12±2.50)%。尿液中樣品的回收率在95% ～105%之間，證明了檢測方法的可靠性。

2.5.4 樣本的分析 隨機(jī)抽取50個(gè)正常人的尿樣作為樣本，用以上已經(jīng)建立好的間接ELISA方法檢測SAL質(zhì)量濃度，檢出質(zhì)量濃度范圍為:ND～30.21 ng/ml，平均質(zhì)量濃度為6.42 ng/ml，檢出率為41.40%。

3 討論

3.1 不同的免疫方式對多克隆抗體制備的影響 小分子沙丁胺醇由于結(jié)構(gòu)簡單，分子量小，直接免疫不能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，因此需要與大分子載體結(jié)合，形成具有免疫原性的人工抗原，才能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體。制備多抗的過程比較復(fù)雜，通常需要使用佐劑，并且需要弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑聯(lián)合使用，才能獲得比較理想的多克隆抗體。另外，免疫劑量和免疫周期對多抗的制備也會(huì)有影響，本實(shí)驗(yàn)通過考察不同的免疫方式對多克隆抗體制備的影響，發(fā)現(xiàn)小劑量長周期的免疫方式獲得的多克隆抗體效價(jià)更高，特異性更好。

3.2 建立間接ELISA的檢測方法 目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于SAL殘留檢測的方法主要有理化方法和免疫學(xué)方法，其中酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)方法是一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好的檢測方法。由于ELISA的試劑比較穩(wěn)定、易于保存、操作簡單等因素，可用于大批樣本的篩選以及定量分析。目前，許多商品化的試劑盒也已經(jīng)面市。ELISA的檢測過程受很多因素的影響，例如反應(yīng)時(shí)間和溫度、反應(yīng)pH、抗原和抗體的稀釋度等，本研究對影響ELISA檢測的因素如包被條件、反應(yīng)時(shí)間和溫度、抗原抗體稀釋度等進(jìn)行了優(yōu)化，在優(yōu)化的基礎(chǔ)上，檢測一系列SAL標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了SAL間接ELISA檢測方法，檢測線可達(dá)2.24 ng/ml，并對方法的靈敏性和精確度進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示方法具有較好的可靠性，利用建立好的間接ELISA檢測方法對人的尿樣進(jìn)行篩選，具有較好的實(shí)用性，為進(jìn)一步開發(fā)商品化的試劑盒打下了良好的基礎(chǔ)?！笆萑饩笔躯}酸克倫特羅、沙丁胺醇等β-腎上腺激動(dòng)劑類藥物的俗稱。本研究所建立的ELISA方法在檢測鹽酸克倫特羅時(shí)，有很高的的交叉反應(yīng)率。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，SAL在人尿中的檢出率可達(dá)100%，這說明小分子環(huán)境污染物的污染問題相當(dāng)嚴(yán)重，導(dǎo)致其在人體內(nèi)大量殘留，嚴(yán)重威脅著人們的健康。

本研究所建立的ELISA方法，可以直接檢測尿樣，取樣方便，對人體沒有損害，可以用于臨床上大規(guī)模的體檢排查。對監(jiān)控和改善人們的生活環(huán)境，提高人們的生活質(zhì)量具有深遠(yuǎn)的意義。

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