趙燕燕，劉麗艷，韓媛媛，李月秋，王 艷，石敏健

（1.河北大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河北 保定 071000；2.河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北省分析科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002）

甘草酸單銨鹽1992年被國家衛(wèi)生部定為治療慢性肝炎的首選藥物，其原料藥主成分是18α-甘草酸（18α-glycyrrhizic acid，18α-Gly）和18β-甘草酸（18β-glycyrrhizic acid，18β-Gly），以及2個(gè)主要的有關(guān)物質(zhì)，分別命名為有關(guān)物質(zhì)A和有關(guān)物質(zhì)B。18α-Gly和18β-Gly為一對(duì)差向異構(gòu)體，其空間構(gòu)型的微小變化使兩者在理化性質(zhì)、藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)及不良反應(yīng)等方面存在著顯著差異。目前關(guān)于甘草酸制劑檢測方法的研究報(bào)道很多，如高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）［1，2］、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法［3，4］、高效液相色譜法［5-10］、氣相色譜法［11］、薄層色譜法［12］、極譜催化波法［13］、紫外分光光度法［14］等。高效液相色譜法具有準(zhǔn)確、快捷、靈敏度高、重現(xiàn)性好和應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)，是原料藥和制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中常用的方法。原料藥中18α-Gly、18β-Gly所占比例及有關(guān)物質(zhì)含量是控制其制劑質(zhì)量和安全的重要指標(biāo)。在中國藥典2010版中沒有收載甘草酸單銨鹽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在歐洲藥典7.0版（EP7.0）和英國藥典2012版（BP2012）收載的甘草酸單銨鹽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，將其主成分結(jié)構(gòu)歸屬為18β-Gly，將其中2個(gè)有關(guān)物質(zhì)分別歸屬為有關(guān)物質(zhì)A（相對(duì)保留時(shí)間約為0.8）和18α-Gly（相對(duì)保留時(shí)間約為1.2），并未提及有關(guān)物質(zhì) B。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)［5］，EP7.0、BP2012和中國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-XG-2002收載的甘草酸單銨鹽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的流動(dòng)相為酸性體系，對(duì)18α-Gly、18β-Gly異構(gòu)體沒有分離選擇性，無法同時(shí)對(duì)其主成分18α-Gly、18β-Gly的含量及有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。由此，對(duì)主成分異構(gòu)體的分離以及對(duì)色譜圖中相對(duì)保留時(shí)間約為1.2的物質(zhì)的結(jié)構(gòu)歸屬有待商榷?，F(xiàn)有的甘草酸類制劑標(biāo)準(zhǔn)中尚未標(biāo)注18α-Gly、18β-Gly所占比例，造成產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量控制的缺失。目前對(duì)甘草酸類制劑中差向異構(gòu)體的分析已有相關(guān)報(bào)道［15，16］，但有關(guān)甘草酸單銨鹽原料藥主成分及有關(guān)物質(zhì)含量檢測方法的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在參考國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)和各國藥典的基礎(chǔ)上，建立了采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）同時(shí)測定甘草酸單銨鹽原料藥主成分及有關(guān)物質(zhì)含量的方法，可用于甘草酸單銨鹽原料藥主成分含量及有關(guān)物質(zhì)的檢測分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-10ATVP高效液相色譜儀（日本島津公司），包括SPD-M10Avp二極管陣列檢測器（DAD）和CLASS-VP工作站；UV-2550紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；AUW120D十萬分之一電子分析天平（日本島津公司）；DELTA-320型酸度計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）；超純化水機(jī)（重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司）。

甘草酸單銨鹽對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào):Y0 000433）、18α-Gly對(duì)照品（ALPS制藥，批號(hào):10B001S）、18β-Gly對(duì)照 品 （ALPS 制藥，批號(hào):05C11S）、有關(guān)物質(zhì) A對(duì)照品（ALPS制藥，批號(hào):10B002S）、有關(guān)物質(zhì)B對(duì)照品（ALPS制藥，批號(hào):10B003S），以上對(duì)照品純度均高于99%；甘草酸單銨鹽原料藥（A廠，批號(hào):V150 860001；B廠，批號(hào):06802N130；C廠，批號(hào):11C8、10E4；D 廠，批號(hào):09 120061）。高氯酸銨、氨水、高氯酸、冰醋酸、三乙胺、磷酸均為分析純。甲醇、乙腈為色譜純（天津市康科德科技有限公司）。水為二次去離子水。

1.2 溶液的配制

對(duì)照品溶液:精密稱定各對(duì)照品適量，分別置于100mL容量瓶中，加入50%甲醇水溶液溶解并定容，分別制成質(zhì)量濃度為1000mg／L的對(duì)照品儲(chǔ)備液，于4℃冰箱中保存。精密量取5mL對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于100mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液:精密稱定各原料藥適量，分別置于100mL容量瓶中，加入50%甲醇水溶液溶解并定容，分別制成質(zhì)量濃度為1000mg／L的供試品儲(chǔ)備液，于4℃冰箱中保存。精密量取5mL供試品儲(chǔ)備液，置于100mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容，搖勻，作為供試品溶液。

混合對(duì)照品溶液:分別精密量取18α-Gly、18β-Gly、有關(guān)物質(zhì)A和有關(guān)物質(zhì)B對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置于同一容量瓶中，用流動(dòng)相定容，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

專屬性試驗(yàn)測試液:精密量取供試品儲(chǔ)備液（C廠，批號(hào):11C8）5mL，加入6mol／L NaOH 溶液1 mL，常溫下放置24h，用6mol／L HCl溶液調(diào)pH值至中性，用流動(dòng)相稀釋至10mL，搖勻，作為堿破壞樣品溶液。精密量取供試品儲(chǔ)備液（C廠，批號(hào):11C8）5mL，加入6mol／L HCl溶液1mL，常溫下放置24h，用6mol／L NaOH溶液調(diào)pH值至中性，用流動(dòng)相稀釋至10mL，搖勻，作為酸破壞樣品溶液。精密量取供試品儲(chǔ)備液（C廠，批號(hào):11C8）5 mL，在160℃恒溫箱中加熱近干，用流動(dòng)相稀釋至10mL，搖勻，作為高溫破壞樣品溶液。精密量取供試品儲(chǔ)備液（C廠，批號(hào):11C8）5mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的雙氧水5mL，放置24h，用流動(dòng)相稀釋至10mL，搖勻，作為氧化破壞樣品溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱:Durashell C18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相:10mmol／L高氯酸銨（氨水調(diào)節(jié)pH 8.20）-甲醇（48∶52，v／v）；流速:0.80mL／min；檢測波長:254nm；柱溫:50℃；進(jìn)樣量:10μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離條件的建立

2.1.1 流動(dòng)相組成、鹽濃度及pH值的選擇

實(shí)驗(yàn)分別考察了反相色譜常用的有機(jī)相溶劑（甲醇和乙腈）與水的混合體系為流動(dòng)相以及在流動(dòng)相中分別添加0.5%冰醋酸、0.6%冰醋酸、60%高氯酸、0.01mol／L磷酸、0.10mol／L磷酸鹽緩沖液等對(duì)18α-Gly、18β-Gly、有關(guān)物質(zhì) A和有關(guān)物質(zhì)B分離效果及其靈敏度的影響。結(jié)果表明，在4種待測物混合對(duì)照品能夠達(dá)到基線分離的前提下，以甲醇-水-60%高氯酸（55∶45∶0.5，v／v／v，氨水調(diào)pH值至8.00）為流動(dòng)相，分離效果最好，靈敏度最高，保留時(shí)間最短。該流動(dòng)相雖解決了兩異構(gòu)體分離的問題，但甲醇-水-60%高氯酸體系的pH值在1.7左右，以氨水調(diào)pH至8.00的操作比較繁瑣；因此采用高氯酸銨代替高氯酸，再用氨水調(diào)pH值至8.20，色譜行為不變，且操作簡單、快捷。

18α-Gly和18β-Gly是一對(duì)差向異構(gòu)體，流動(dòng)相的pH值顯著影響該異構(gòu)體的拆分，同時(shí)分離18α-Gly和18β-Gly需在pH≥7的條件下進(jìn)行。歐洲藥典7.0版、英國藥典2012版、中國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-XG-2002收載的甘草酸單銨鹽藥品標(biāo)準(zhǔn)方法中采用的流動(dòng)相分別為冰醋酸-乙腈-水（6∶380∶614，v／v／v）（歐洲藥典和英國藥典）和0.01mol／L磷酸-乙腈（62∶38，v／v）（WS1-XG-2002），均為酸性體系，對(duì)18α-Gly、18β-Gly異構(gòu)體沒有分離選擇性（見圖1）。

圖1 采用（a）歐洲藥典7.0版／英國藥典2012版和（b）中國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)收載的甘草酸單銨鹽標(biāo)準(zhǔn)方法得到的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of raw material drug of ammonium glycyrrhizinate with the methods of（a）European Pharmacopoeia 7.0 version／British Pharmacopoeia 2012 version and （b）the National Drug Standards of China

實(shí)驗(yàn)考察了高氯酸銨濃度在5～100mmol／L范圍內(nèi)對(duì)各色譜峰的分離度、靈敏度以及保留時(shí)間的影響。結(jié)果表明，當(dāng)高氯酸銨的濃度從5 mmol／L升高至10mmol／L時(shí)，4種待測物的靈敏度均達(dá)到最大值，但對(duì)分離度及各色譜峰保留時(shí)間的影響不明顯；繼續(xù)增加高氯酸銨的濃度，可以改善4種待測物的分離度，但會(huì)導(dǎo)致靈敏度下降，各色譜峰的保留時(shí)間延長。實(shí)驗(yàn)選擇高氯酸銨濃度為10 mmol／L。

實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相pH值（6.45～8.93）對(duì)各色譜峰的分離度、靈敏度以及保留時(shí)間的影響。結(jié)果表明，pH值從6.45升高至8.20，4種待測物的靈敏度均增加，各色譜峰的保留時(shí)間明顯縮短；pH＝8.20時(shí)，18α-Gly和18β-Gly剛好達(dá)到基線分離；繼續(xù)增大pH值，除有關(guān)物質(zhì)A外，其他3種待測物的靈敏度仍隨之增加，但對(duì)18α-Gly、18β-Gly異構(gòu)體的分離選擇性降低。兼顧分離度和靈敏度的要求，實(shí)驗(yàn)選擇pH值為8.20。

2.1.2 有機(jī)相加入比例的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相中甲醇加入比例（45%、50%、52%、55%、60%，v／v）對(duì)各色譜峰的分離度、靈敏度以及保留時(shí)間的影響。結(jié)果表明，隨著甲醇加入比例的增加，各色譜峰的保留時(shí)間逐漸縮短、靈敏度逐漸增加；當(dāng)甲醇的加入比例為52%時(shí)，差向異構(gòu)體18α-Gly和18β-Gly恰好達(dá)到基線分離；甲醇含量繼續(xù)增大，兩差向異構(gòu)體的分離度小于1.5，不符合藥典要求。實(shí)驗(yàn)選用甲醇加入比例為52%。

2.1.3 柱溫及流速的選擇

許多研究表明，溫度對(duì)手性化合物的保留因子、分離度和柱效有一定的影響［17］。實(shí)驗(yàn)考察了柱溫（25、30、40、45、50℃）對(duì)各色譜峰的分離度、靈敏度以及保留時(shí)間的影響。結(jié)果表明，隨著柱溫的升高，4種待測物的靈敏度增加，各色譜峰的保留時(shí)間縮短，分離度降低，但不影響基線分離。當(dāng)柱溫大于50℃時(shí)，會(huì)降低色譜柱使用壽命。在不影響分離且不損壞色譜柱的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)選擇柱溫為50℃。

實(shí)驗(yàn)考察了流速（1.20、1.00、0.80、0.60、0.40 mL／min）對(duì)各色譜峰的分離度、靈敏度以及保留時(shí)間的影響。結(jié)果表明，隨著流速的降低，理論塔板高度降低，理論塔板數(shù)增加，4種待測物的靈敏度和分離度均有一定程度的提高，但各色譜峰的保留時(shí)間顯著延長；當(dāng)流速為0.80mL／min時(shí)，18α-Gly和18β-Gly達(dá)到基線分離；流速繼續(xù)降低，各色譜峰的保留時(shí)間延長，影響快速分離。綜合分析，實(shí)驗(yàn)選擇0.80mL／min為最佳流速。

實(shí)驗(yàn)表明，采用1.3節(jié)色譜條件時(shí)的分離效果最佳。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別量取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、供試品加標(biāo)溶液按1.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)測定結(jié)果見表1，色譜圖見圖2。

表1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)測定結(jié)果Table 1 Results of system suitability test

2.3 方法專屬性試驗(yàn)

分別量取酸破壞、堿破壞、高溫破壞、氧化破壞樣品溶液，按1.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，在酸、堿、高溫、氧化等破壞條件下得到的降解產(chǎn)物在該色譜條件下均能與18α-Gly、18β-Gly、有關(guān)物質(zhì)A和有關(guān)物質(zhì)B色譜峰良好分離，說明所建立的HPLC法具有良好的專屬性。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系和檢出限

圖2 （a）混合標(biāo)準(zhǔn)品、（b）供試品及（c）加標(biāo)供試品的色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of（a）a mixture of standards，（b）a sample and（c）the sample spiked with the mixture of standards

精密量取18α-Gly、18β-Gly、有關(guān)物質(zhì) A 和有關(guān)物質(zhì)B對(duì)照品儲(chǔ)備液各1mL，分別置于10mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度各為100mg／L的對(duì)照品溶液，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋，得到一系列質(zhì)量濃度不同的溶液，按照1.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以峰面積Y對(duì)質(zhì)量濃度X（mg／L）作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；按3倍信噪比（S／N＝3）確定檢出限。甘草酸單銨鹽中主成分及有關(guān)物質(zhì)的線性方程、線性范圍及檢出限見表2。

表2 甘草酸單銨鹽中主成分及有關(guān)物質(zhì)的線性關(guān)系及檢出限Table 2 Regression relationships and detection limits of principal components and related substances of ammonium glycyrrhizinate

2.4.2 儀器的精密度

取混合對(duì)照品溶液，按照1.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果表明，各色譜峰的保留時(shí)間波動(dòng)小于0.02min（n＝6），峰面積的 RSD為0.05%～0.36%（n＝6）。

2.4.3 方法的精密度

取同一批次的甘草酸單銨鹽原料藥（C廠，批號(hào):11C8）的供試品溶液6份，按照1.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，各色譜峰的保留時(shí)間波動(dòng)小于0.02min（n＝6），峰面積的 RSD 為0.06%～0.57%（n＝6）。

2.4.4 穩(wěn)定性

取甘草酸單銨鹽原料藥（C廠，批號(hào):11C8）的供試品溶液，按照1.3節(jié)色譜條件，分別放置0、6、12、24、48、72h時(shí)進(jìn)樣分析，各色譜峰峰面積的RSD范圍為0.39%～1.06%（n＝6），表明制備好的供試品溶液在3d內(nèi)檢測穩(wěn)定性良好。

2.4.5 回收率

精密量取甘草酸單銨鹽原料藥（C廠，批號(hào):11C8）供試品溶液，按該供試品溶液中各待測物濃度的80%、100%、120%分別加入18α-Gly、18β-Gly、有關(guān)物質(zhì)A和有關(guān)物質(zhì)B的對(duì)照品，按照1.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。甘草酸單銨鹽中主成分及有關(guān)物質(zhì)的加標(biāo)回收率見表3。

表3 甘草酸單銨鹽中主成分及有關(guān)物質(zhì)的加標(biāo)回收率（n＝3）Table 3 Spiked recoveries of principal components and related substances of ammonium glycyrrhizinate（n＝3）

2.5 實(shí)際樣品中主成分及有關(guān)物質(zhì)含量的測定

取對(duì)照品溶液，按照1.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的25%。分別取不同廠家生產(chǎn)的甘草酸單銨鹽供試品溶液，按照1.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖至供試品溶液中主峰18β-Gly保留時(shí)間的3倍，分別計(jì)算4種待測物的含量，結(jié)果見表4，甘草酸單銨鹽對(duì)照品的色譜圖見圖3。

表4 不同生產(chǎn)廠家的甘草酸單銨鹽原料藥中主成分及有關(guān)物質(zhì)的含量（n＝3）Table 4 Contents of principal components and related substances in raw material drugs of ammonium glycyrrhizinate from different manufacturers（n＝3）

圖3 甘草酸單銨鹽對(duì)照品的色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of reference substances of ammonium glycyrrhizinate

3 結(jié)論

本工作在參考國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)和各國藥典的基礎(chǔ)上，建立了同時(shí)測定甘草酸單銨鹽原料藥主成分及有關(guān)物質(zhì)含量的RP-HPLC法。與歐洲藥典7.0版、英國藥典2012版和中國國家藥品標(biāo)準(zhǔn) WS1-XG-2002收載的甘草酸單銨鹽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法相比，實(shí)現(xiàn)了對(duì)甘草酸單銨鹽原料藥主成分異構(gòu)體18α-Gly和18β-Gly的有效分離，使其主成分以及有關(guān)物質(zhì)A和有關(guān)物質(zhì)B在單一流動(dòng)相、單流速、等度洗脫條件下取得良好的分離。該方法分離時(shí)間短，檢出限低，分離度好，線性范圍寬，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可作為甘草酸單銨鹽的檢測方法，用于甘草酸單銨鹽原料藥主成分、有關(guān)物質(zhì)含量的檢測與分析，從而用于其原料藥和制劑的質(zhì)量控制，對(duì)甘草酸單銨鹽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂具有一定的參考價(jià)值。

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