許 波，于 靚，熊儒先，繆禮鴻

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430023)

富營養(yǎng)化是我國目前及今后相當(dāng)長一段時期內(nèi)的重大水環(huán)境問題，富營養(yǎng)化帶來的一個突出問題是藍(lán)藻水華暴發(fā)導(dǎo)致水中溶解氧含量下降，水質(zhì)嚴(yán)重惡化，并產(chǎn)生毒素，嚴(yán)重破壞原有水體的生態(tài)環(huán)境［1］。在利用物理、化學(xué)和其它生物方法治理水華不甚理想的情況下，研究利用溶藻細(xì)菌防治水華和赤潮已經(jīng)引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注［2］。溶藻細(xì)菌(Algae-lysing bacterium)能夠通過直接或間接方式，抑制藻類生長或殺死藻類，從而溶解藻細(xì)胞［3］。近年來，國內(nèi)外不斷分離和發(fā)現(xiàn)新的溶藻細(xì)菌［4－5］。已報道的溶藻細(xì)菌主要有弧菌、假單胞菌、黃桿菌、交替單胞菌等，它們的作用對象比較廣泛，既有藍(lán)藻也有甲藻和硅藻，這些溶藻細(xì)菌多數(shù)是通過分泌胞外物質(zhì)到環(huán)境中抑制藻的生長，導(dǎo)致藻細(xì)胞的溶解，如分泌蛋白質(zhì)、抗生素、氨基酸［6－8］等。本文報道了一株芽孢桿菌產(chǎn)生的溶藻活性物質(zhì)的特性及其影響因子。

1 材料和方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

銅綠微囊藻 (Microcystis aeruginosa，F(xiàn)ACHB 905)，由中科院水生生物所藻種保藏中心(FACHB)提供，其無菌銅綠微囊藻905A由本實驗室分離純化獲得。藻種培養(yǎng)采用BG11培養(yǎng)基。

供試細(xì)菌及培養(yǎng):T1芽孢桿菌為本實驗室分離保存。T1芽孢桿菌培養(yǎng)基:芽孢桿菌的培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基［9］，其中固體培養(yǎng)基的瓊脂含量為2%。

1.2 T1芽孢桿菌生長曲線的測定

細(xì)菌生長曲線的測定參考［9］。將經(jīng)過活化的T1芽孢桿菌菌液轉(zhuǎn)接到100 mL LB培養(yǎng)基中，在37℃，170 r/min的條件下培養(yǎng)，每隔4 h取樣測定測OD值。

1.3 高溫處理對T1濾液溶藻活性的影響

取1 mL T1無菌濾液(5 000 r/min離心，用0.25 μm無菌纖維素酯微孔濾膜過濾)，分別用80℃水浴處理和115℃高壓蒸汽滅菌鍋處理30 min，按接種量2%分別加入銅綠微囊藻液905A中光照培養(yǎng)，藻細(xì)胞初始濃度約為1.0×106個/mL、體積為10 mL，在30 ℃、2 000 lux、14∶10(光∶暗)恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，空白對照分別為在相同藻液中加入2%的無菌水和LB培養(yǎng)液，每組做2個平行對照，每隔24 h用血球計數(shù)板法測得藻數(shù)。

1.4 不同培養(yǎng)基對T1芽孢桿菌溶藻活性的影響

分別用牛肉膏和LB培養(yǎng)基37℃活化并培養(yǎng)T1菌株在37℃，170 r/min的條件下，取36 h的發(fā)酵液，按2%添加量分別接入兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的T1菌液，加入到10 mL初濃度為106個/mL的微囊藻905藻液中，放置在恒溫光照培養(yǎng)箱中25℃、2 000 lux、14∶10(光∶暗)的條件下培養(yǎng)，空白對照分別加入2%的培養(yǎng)基到微囊藻905A藻液中，每組做2個平行對照，每隔24 h用血球計數(shù)板法測得藻數(shù)。

1.5 不同pH條件下T1對銅綠微囊藻905A的溶藻作用

將新鮮培養(yǎng)的微囊藻905A分別接入到無菌的pH=9.0，pH=4.0 及未調(diào) pH(pH=7.0) 的 BG11液體培養(yǎng)基中，測得初始藻濃度為1.0×106個/mL。按2%分別接入無菌水(CK)和已用LB培養(yǎng)基活化待用的T1菌液(菌液初始濃度為1.16×106個/mL)，在30 ℃、2 000 lux、14∶10(光∶暗)的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組做2個平行對照，每隔24 h用血球計數(shù)板法測得藻數(shù)，并計算抑藻率。藻細(xì)胞數(shù)抑藻率(%)=［(對照樣藻細(xì)胞數(shù)－處理樣藻細(xì)胞數(shù))/對照樣藻細(xì)胞數(shù)］×100%。

1.6 不同濃度蛋白酶K作用下對T1溶藻的影響

將T1芽孢桿菌活化接種到LB液體培養(yǎng)基中，在37℃，170 r/min條件下發(fā)酵24 h，經(jīng)離心及微孔濾膜過濾除菌后獲得T1無菌濾液，按2%加量將T1無菌濾液加入到初始藻細(xì)胞濃度約為1.0×106個/mL、體積為10 mL銅綠微囊藻液905A中，并將配好的蛋白酶K溶液加入藻液中，使藻液中蛋白酶K濃度分別達(dá)到 20 mg/mL，10 mg/mL，5 mg/mL，對照組中1組不加蛋白酶K溶液，另外1組加入2%的LB培養(yǎng)基作為空白對照，每組做2個平行對照，于30℃、2 000 lux，14∶10(光∶暗)恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，測定藻數(shù)變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 T1芽孢桿菌生長曲線的測定

從圖1可以看出，菌株T1的延緩期很短，培養(yǎng)24 h左右菌液的OD值達(dá)到最大值，20—28 h處于穩(wěn)定期，28h以后菌體進(jìn)入衰亡期。

圖1 T1菌株的生長曲線

2.2 T1芽孢桿菌溶藻活性物質(zhì)的耐熱性測定

結(jié)果表明(圖2)，經(jīng)過80℃和115℃高溫處理的2個T1無菌濾液樣品的溶藻活性與未處理的對照相比沒有明顯下降，表明T1芽孢桿菌產(chǎn)生的溶藻活性物質(zhì)具有較好的耐高溫性能。

圖2 高溫處理對T1無菌濾液溶藻活性的影響

2.3 培養(yǎng)基對溶藻活性的影響

如圖3所示，牛肉膏培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基本身有微弱的溶藻作用，可能與培養(yǎng)基中存在某些氨基酸等抑藻成分有關(guān)。而2種培養(yǎng)基分別接種T1芽孢桿菌培養(yǎng)后的菌液溶藻活性顯著增加，表明細(xì)菌培養(yǎng)過程中有新的溶藻活性物質(zhì)產(chǎn)生。采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的T1菌液在第4 d就將銅綠微囊藻905A完全裂解，比用牛肉膏培養(yǎng)基培養(yǎng)菌液溶藻時間縮短了1 d，表明用LB培養(yǎng)基比牛肉膏培養(yǎng)基培養(yǎng)的T1菌液的溶藻活性更高。

圖3 培養(yǎng)基對T1溶藻效果的影響

2.4 水體pH值對溶藻效果的影響

實驗結(jié)果顯示(圖4)，T1芽孢桿菌溶藻效果與水體pH值有關(guān)。水體pH=9時T1芽孢桿菌的溶藻效果最好，pH=7次之，pH=4最差，添加無菌水和LB培養(yǎng)基的2個對照組微囊藻905A的生長狀況相差不大。表明當(dāng)T1芽孢桿菌在弱堿性環(huán)境中的溶藻活性最高，3—4 d時間內(nèi)抑藻率達(dá)到98%以上。

2.5 蛋白酶對T1芽孢桿菌溶藻活性的影響

實驗結(jié)果表明(圖5)，加入不同濃度的蛋白酶K后，T1無菌濾液的溶藻活性并沒有受到明顯的影響。由此可以推測，T1芽孢桿菌產(chǎn)生的溶藻活性物

圖4 水體pH對T1芽孢桿菌溶藻效果的影響質(zhì)不是蛋白質(zhì)類。

圖5 不同濃度蛋白酶K作用下對T1溶藻差異比較

3 結(jié)論

溶藻芽孢桿菌T1在37℃、170 r/min的條件下培養(yǎng)20h活菌數(shù)達(dá)到最大值。采用LB培養(yǎng)基比用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)T1菌液的溶藻活性更強(qiáng)。經(jīng)80℃和115℃高溫處理的T1無菌濾液的溶藻活性與未經(jīng)過處理對照無明顯差異，表明T1產(chǎn)生的溶藻活性物質(zhì)具有較好的耐熱性。T1的溶藻活性與水體pH有關(guān)，堿性條件下T1的溶藻活性比酸性條件下高。T1芽孢桿菌無菌濾液經(jīng)蛋白酶K處理后其溶藻活性沒有明顯變化，推測T1能夠產(chǎn)生非蛋白質(zhì)類溶藻活性物質(zhì)。

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