何 舟，陳 新，楊 桃，李 龍，胡 海，許 旭

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430023)

箬葉為禾本科(Graminales)竹亞科(Bambusoideae Nees)箬竹屬(Indocalmus)植物葉的總稱，該屬約含20種，均產(chǎn)我國［1］。箬葉在我國具有悠久的藥用和食用歷史，具有清熱解毒、抗菌消炎、保肝利膽的功能［2］。臨床應(yīng)用于治療呼吸道感染、頭痛咽痛等疾?。?］。一是抗菌及抗病毒，二是抗炎解熱、抗腫瘤［4］。箬葉中含有大量的黃酮類化合物，從九十年代開始人們對(duì)黃酮類活性物質(zhì)研究就開始了，主要表現(xiàn)為抗氧化、分離純化等方面。近年來，國內(nèi)外學(xué)著對(duì)黃酮化合物抑制微生物的研究逐步深入，最新的研究結(jié)果表明，箬葉中含有大量的黃酮類化合物和生物活性多糖等有效成分，其中的酚酸類化合物、葸醌類化合物、萜類內(nèi)酯和生物堿等都有著較強(qiáng)的抑菌殺菌作用［5］。箬葉提取物對(duì)大腸桿菌、枯草牙孢桿菌、金黃色葡萄球菌、蘇云金牙孢桿菌具有廣泛的抑制作用，其抑制效果隨作用時(shí)間延長和使用提取液濃度的提高而增強(qiáng)［6］。箬葉中有效抑菌活性成分提取具有重大意義，箬葉中有效抑菌活性成分提取物在金黃色葡萄球菌，大腸桿菌這類細(xì)菌上抑菌效果顯著［7］，開發(fā)這類抑菌藥物前景廣大［8］。

本實(shí)驗(yàn)首先探討不同提取液對(duì)箬葉抑菌活性的影響，確定采用水提取箬葉中抑菌活性成分，進(jìn)而擬定箬葉水提液抑菌作用為觀測(cè)指標(biāo)，利用單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，旨在探討該方法提取的最佳工藝，為進(jìn)一步提取利用箬葉中抑菌活性成分貢獻(xiàn)有重大價(jià)值的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

箬葉，由武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供

1.1.2 試劑儀器

氫氧化鈉(AR)、氯化鈉(AR)、冰醋酸(AR)、乙醇(AR)、石油醚(AR)、氯仿(AR)、正丁醇(AR)、乙酸乙酯(AR)，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl5.0 g/L，pH7.0—7.2;供試菌種:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus.arueus)大腸桿菌(Escherichia.coli)，由武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供

AL204－01型電子天平，梅特勒－托利多儀器有限公司;RE52－99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器，上海亞榮生化儀器廠;SPX－300BSH－II型生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;HQ45Z型恒溫?fù)u床，武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司;JJ－CJ－2FD型超凈工作臺(tái)，蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司;752N可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同提取液制備樣品方法比較

用箬葉制備水提液備用，其中一份加入醋酸另一份不作處理。用箬葉制備醇提液備用，(乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%，40%，50%，60%，70%)其中一份加入醋酸另一份不作處理。利用提取液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，測(cè)定抑菌圈大小。由于醋酸對(duì)提取液抑菌效果具有協(xié)同作用，使抑菌效果更為明顯，故設(shè)置酸抑菌對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 箬葉水提取法的單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試

以抑菌圈直徑為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，首先擬定提取溫度、料液比、提取時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)工藝參數(shù)范圍，采用Box－Behnken設(shè)計(jì)方案，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的線性擬合和方差分析確定箬葉抑菌活性成分提取的最佳工藝。

1.2.3 樣品及對(duì)照組的箬葉抑菌活性實(shí)驗(yàn)

將直徑為6 mm的濾紙片盛于培養(yǎng)皿中滅菌，經(jīng)高壓蒸汽滅菌，121—126℃滅菌30 min后置于50℃烘箱內(nèi)烘2 h，將濾紙片放入分別置不同濃度的供試樣品中，浸泡30 min。對(duì)照組用無菌蒸餾水浸泡30 min。將滅過菌的鑷子取濾紙圓片，無菌操作放入菌液平板上(每個(gè)皿正六邊形對(duì)稱放6張濾紙圓片，其中三片用蒸餾水對(duì)照)，做三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)菌平板倒置37℃恒溫培養(yǎng)18—24 h，測(cè)定抑菌圈直徑，計(jì)算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取液對(duì)箬葉抑菌活性影響

準(zhǔn)確稱取箬葉200 g，置3 000 mL燒瓶中，箬葉比水為1∶10比例加入蒸餾水，60℃恒溫水浴加熱，備用。將濾液濃度配制成2 g/mL，其中一份加入體積比(藥液:醋酸20∶1)的醋酸，另一份不作處理，醇提取方法同上，另外配制2 g/mL的醋酸溶液，結(jié)果見表1和圖1。

表1 水和一定體積分?jǐn)?shù)醇加酸前后抑菌效果比較

圖1 水和一定體積分?jǐn)?shù)醇加酸前后抑菌效果比較

從左至右依次為大腸桿菌水提液，大腸桿菌水提液加酸，金黃色葡萄球菌水提液，金黃色葡萄球菌水提液加酸。通過圖1和表1可以得到，提取液加酸后抑菌效果比不作處理的顯著。大腸桿菌抑菌效果普遍大于金黃色葡萄球菌，故下面抑菌實(shí)驗(yàn)中選擇大腸桿菌為觀測(cè)指標(biāo)菌。

2.2 箬葉提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 提取溫度對(duì)箬葉水提取物抑菌活性影響

圖2至圖4中，菱形折線代表大腸桿菌抑菌效果曲線，正方形折線代表金黃色葡萄球菌抑菌效果曲線。

由圖2得到，當(dāng)溫度達(dá)60℃時(shí)箬葉提取物抑菌活性成分對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果都達(dá)到最強(qiáng)，故選擇最佳提取溫度為60℃。

圖2 提取溫度對(duì)箬葉水提取物抑菌活性影響

2.2.2 料液比對(duì)箬葉水提取物抑菌活性影響

由圖3得到，隨著料液比值的增加，箬葉活性物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制微慢上升后趨于平緩。為了節(jié)約成本，選擇料液比1∶10(g∶mL)最佳。

圖3 料液比對(duì)箬葉水提取物抑菌活性影響

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)箬葉水提取物抑菌活性影響

由圖4得到:隨著提取時(shí)間的增加，箬葉提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果逐漸增強(qiáng)。提取時(shí)間增加至2.5 h后，箬葉活性物對(duì)兩種菌的抑制效果趨于平衡，故選擇最佳提取時(shí)間2.5 h。

圖4 提取時(shí)間對(duì)箬葉水提取物抑菌活性影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design－Expert.v8.0.6響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)之中心組合實(shí)驗(yàn)Box－Behnken設(shè)計(jì)方案［9］。選三個(gè)因素:提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(C)，以抑菌圈(Y)為指標(biāo)見表2、表3。并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合和方差分析，考察因素顯著性見表4。根據(jù)回歸方程，響應(yīng)面曲線圖，等高線圖，分析各因素交互作用的顯著性，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖5—圖7)。

對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得各因素與抑菌圈大小的二次多項(xiàng)回歸方程為

表2 Box－Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平

表3 Box－Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

表4 擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析

由表4可以看出:抑菌效果顯著性大小依次為B＞A＞C。方程復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.9843，說明該模型顯著性好;失擬性大于0.05不顯著，說明方程誤差小。Radj 2=0.964 0，說明該模型能夠反映96.40%響應(yīng)值的變化，較好反映提取條件對(duì)抑菌效果的變化規(guī)律。

圖5

圖6

圖7

由圖5至圖7可知:提取時(shí)間與液料比相互作用極為顯著(P=0.0093＜0.01)，提取溫度與液料比相互作用對(duì)抑菌圈影響較為顯著(P=0.0339＜0.05)，提取時(shí)間與提取溫度相互作用不是很顯著(P=0.4561 ＞0.01)。

通過響應(yīng)面優(yōu)化箬葉抑菌活性成分抑菌最佳提取工藝條件:提取溫度50℃，提取時(shí)間2.89 h，液料比9.44。抑菌圈預(yù)測(cè)值14.073 5 mm。對(duì)提取最佳工藝進(jìn)行修正:提取溫度50℃，提取時(shí)間3 h，料液比1∶10(g∶mL)，抑菌圈實(shí)際值13.873 5 mm。實(shí)際值與預(yù)測(cè)值差異較小，說明響應(yīng)面模型優(yōu)化設(shè)計(jì)適合箬葉抑菌活性成分提取工藝。

3 結(jié)論

本文進(jìn)行不同提取液對(duì)箬葉抑菌活性影響探討，得出結(jié)論:水提取效果優(yōu)于醇提取，提取液加酸后抑菌效果比不作處理的顯著，大腸桿菌抑菌效果普遍大于金黃色葡萄球菌。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇大腸桿菌為觀測(cè)指標(biāo)菌。

利用抑菌實(shí)驗(yàn)，對(duì)箬葉抑菌活性部位水提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用單因素及響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到最佳提取條件:提取溫度50℃，料液比1∶10(g∶mL)，提取時(shí)間3 h。抑菌圈大小為13.8735 mm。結(jié)果表明箬葉水提取液對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出較好抑菌效果，開發(fā)箬葉中有效抑菌活性成分意義深遠(yuǎn)。

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