海 艦，蘇少華，吳一芳，余 飛

同濟大學附屬同濟醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200065

慢性腦低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)屬于一種常見的病理現(xiàn)象，多見于腦動靜脈畸形、頸動脈狹窄或閉塞、硬膜動靜脈瘺、腦動脈硬化、阿爾茨默氏病等［1-3］。長期腦低灌注可誘導認知功能障礙，臨床表現(xiàn)為血管性癡呆，盡管急性腦缺血研究的較為廣泛，但慢性腦低灌注對腦功能的影響，特別是認知功能尚少有研究［4］。臨床證據(jù)表明改善CCH有助于患者認知功能的恢復［5］，由此可見，CCH在認知功能障礙的病理發(fā)生過程中起著重要作用，但CCH導致認知功能障礙的分子機制尚不清楚。認知功能主要包括學習和記憶功能，突觸可塑性對維持認知功能至關(guān)重要［6］。臨床上，由于受到多種不同因素如年齡、系統(tǒng)性疾病、教育背景等影響，難以準確判斷CCH和認知功能之間的關(guān)系［3］，而通過建立單純的慢性腦低灌注動物模型有助于相關(guān)病因?qū)W研究。雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎是目前常用的研究慢性腦低灌注動物模型，而臨床上很少發(fā)現(xiàn)雙側(cè)頸總動脈同時閉塞情況［7］。為此，我們基于腦動靜脈畸形的血流動力學特征，通過右側(cè)頸外靜脈和頸總動脈端側(cè)吻合，同時結(jié)扎雙側(cè)頸外動脈和左側(cè)橫竇引流靜脈，建立了一種改良的CCH動物模型［8］，進一步研究CCH對大鼠認知功能及其海馬區(qū)突觸可塑性的影響。

1 材料與方法

1.1 CCH動物模型的建立

8，12只SD模型組大鼠(200～250 g)，3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉后固定于動物實驗臺上，手術(shù)顯微鏡下分離暴露右側(cè)頸外靜脈、頸總動脈，11-0尼龍絲線行頸外靜脈和頸總動脈端側(cè)吻合，再結(jié)扎雙側(cè)頸外動脈和左側(cè)橫竇引流靜脈。12只鼠齡相同的大鼠僅結(jié)扎右側(cè)頸外靜脈和雙側(cè)頸外動脈，作為手術(shù)對照組。飼養(yǎng)3個月后進行相關(guān)實驗研究。

1.2 水迷宮實驗

按照參考文獻9方法進行水迷宮實驗，水迷宮為一圓形水槽，直徑1.8 m，高度0.6 m，水深35 cm，水溫保持在25±1℃。目標平臺直徑9 cm，位于水面下2 cm，游泳路徑由計算機錄像系統(tǒng)實時記錄，所有大鼠每天進行連續(xù)4天訓練，每天4次，每次間隔1 h。動物每次入水象限隨機分配，面向池壁入水，將大鼠尋找平臺時間設定為90 s，平臺上停留30 s，如在規(guī)定時間未找到平臺，可人工引導到平臺，記錄游泳速度和到達平臺的潛伏期。第5天進行空間探究實驗，移除可視平臺，設定游泳時間為60 s，記錄各組動物在平臺象限的停留時間和跨越平臺象限的次數(shù)。

1.3 HE 染色

水迷宮實驗后每組取4只動物進行HE染色，過量麻醉，經(jīng)心臟在體灌注200 ml 4℃ 0.1 mol/L PBS，再灌注200毫升4%多聚甲醛緩沖液。矢狀縫后3～4 mm區(qū)冠狀腦組織塊，常規(guī)后固定，石蠟包埋，5μm切片，HE染色。

1.4 免疫組化

每組4只動物，矢狀縫后3～4 mm冠狀取腦組織塊，冰凍切片，厚度30μm，采用免疫熒光雙染法，0.01 mol/L醋酸鈉緩沖液中微波抗原修復10 min，0.2%Triton-X100-PBS洗滌5 min，3%小牛血清封閉30 min，MAP-2一抗(1∶200，Sigma)4 ℃孵育過夜，帶熒光素標記二抗 (1∶500，Dako)和4μg/ml PI(Sigma)孵育1小時，LSM 510 META激光共聚焦顯微鏡觀察 (Zeiss)。

1.5 蛋白印跡

每組4只動物，深度麻醉后處死，取海馬組織，2～3 ml緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L EDTA，25 μg/ml aprotinin，25 μg/ml leupeptin，1 mmol/L Na4P2O7，500 μmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride，4 mmol/L para-nitrophenylphosphate，and 1 mmol/L sodium orthovanadate)，采用BCA法蛋白定量，40μg蛋白10%凝膠蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，MAP-2，GAP-43和突觸素(synaptophysin)一抗孵育，二抗孵育，ECL法顯色，密度掃描定量分析。

1.6 統(tǒng)計分析

定量資料以均數(shù)±標準差表示，方差分析和t檢驗進行統(tǒng)計學分析，p＜0.05表示差別具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 認知功能評估

水迷宮是評價動物學習、記憶等認知功能的重要方法［10］，與對照組動物相比，模型組動物尋找平臺的潛伏期明顯延長，而兩組動物之間的游泳速度并無明顯差異，說明兩組動物的運動功能無明顯改變，模型組動物的學習能力下降與感覺運動功能無關(guān)。空間記憶功能測試發(fā)現(xiàn)模型組動物在平臺象限的停留時間和跨越平臺象限的次數(shù)明顯減少，結(jié)果表明CCH可誘導大鼠學習和記憶等認知功能障礙。

2.2 組織學檢查

HE染色光學顯微鏡下觀察兩組動物腦組織中未見明顯的腦梗塞表現(xiàn)。

2.3 CCH對MAP-2表達的影響

采用免疫熒光雙染法觀察兩組動物海馬CA1區(qū)MAP-2免疫原性，MAP-2主要在胞體和樹突表達(綠色)，PI染色胞核(紅色)，與對照組動物相比，模型組動物海馬CA1區(qū)神經(jīng)元MAP-2表達明顯降低 (Fig.1)。

圖1 對照組(A)和模型組(B)動物海馬CA1區(qū)神經(jīng)元MAP－2免疫組化、染色，MAP染色呈綠色，PI染色為紅色(放大倍數(shù)(200)Fig.1 MAP-2 immunoreactivity(green)counterstained with PI(red)in the happocampalregion of the control(A)and model rats(B)(magnification(200).

2.4 CCH對MAP-2，GAP-43和突觸素表達影響的定量分析

免疫印跡檢測兩組動物海馬組織中MAP-2，GAP-43和突觸素表達變化，結(jié)果顯示模型組動物海馬組織中MAP-2和突觸素的表達較對照組動物明顯降低，而兩組動物之間GAP-43表達無明顯差異(Fig.2)。

3 討論

巨大的腦動靜脈畸形、腦動脈硬化、嚴重的雙側(cè)頸動脈閉塞等疾病病理發(fā)生過程常伴有CCH［1，11］，盡管炎性因素可能與CCH所致的神經(jīng)病理學改變有關(guān)［12］，但CCH對認知功能影響尚不清楚，本研究表明，CCH可誘導大鼠認知功能障礙，包括學習和記憶功能。

圖2 對照組(Con)和模型組(M)動物海馬組織中MAP－2，GAP－43，和突觸素(synaptophysin)表達(A)，B為定量分析結(jié)果Fig.2 Representative western blotting for MAP-2，GAP-43，and synaptophysin expression(A)of the hippocampal regions in the control(Con)and model(M)rats.The protein levels of MAP-2，GAP-43，and synaptophysin expression are quantified by densitometric analysis(B).Data represent mean ± SEM(n=4).*p ＜0.05 vs.the control group

腦動靜脈畸形患者的主要血流動力學改變是顱內(nèi)動靜脈分流導致病灶周圍腦組織灌注壓下降［13］，目前已有多種動物模型試圖模擬腦動靜脈畸形所致的血流動力學改變，Spetzler等創(chuàng)建的動物模型是通過靜脈血液逆行進入系統(tǒng)循環(huán)，但顱內(nèi)靜脈壓升高并不明顯［14］，Morgan等制作的動物模型是通過動脈和靜脈端端吻合，頸內(nèi)動脈血液直接流入顱內(nèi)靜脈系統(tǒng)，靜脈高壓明顯，但系統(tǒng)動脈壓降低不明顯［15］。我們基于腦動靜脈畸形的基本血流動力學特征，采用右側(cè)頸外靜脈和頸總動脈端側(cè)吻合的方法造成系統(tǒng)動脈分流，結(jié)扎雙側(cè)頸外動脈以阻斷顱外動脈向顱內(nèi)供血，同時結(jié)扎對側(cè)橫竇引流靜脈以造成顱內(nèi)靜脈高壓［8］，結(jié)果形成穩(wěn)定的顱內(nèi)供血動脈低壓和引流靜脈高壓，有效地降低了腦灌注壓，我們通過組織學檢查發(fā)現(xiàn)模型組動物未見明顯的腦梗塞表現(xiàn)［16-17］。

MAP-2是一種細胞骨架蛋白，主要位于神經(jīng)元樹突，MAP-2表達與樹突生長、損傷后樹突重塑等有關(guān)［18］。MAP-2免疫原性降低是評價永久性和短暫性腦卒中后缺血性損傷的一個敏感指標［19］，我們通過免疫組化和蛋白印跡方法檢測發(fā)現(xiàn)模型組動物海馬組織中MAP-2表達明顯降低，MAP-2表達水平下降可能導致細胞骨架蛋白之間的異常聯(lián)系和(或)細胞內(nèi)微管異常組合，進而影響與海馬結(jié)構(gòu)有關(guān)的學習行為和空間記憶功能。

突觸素是一種38 kDa鈣結(jié)合糖蛋白，位于突觸前小泡膜上，參與了神經(jīng)突觸的發(fā)育和可塑性［20］，突觸素表達水平常用于反映突觸數(shù)量和密度。本研究發(fā)現(xiàn)CCH可誘導動物海馬組織中突觸素表達下調(diào)，可能與CCH所致的認知功能障礙有關(guān)。同時，突觸素也是突觸前小泡膜上神經(jīng)遞質(zhì)傳輸?shù)闹匾煞?，突觸素下降可直接影響突觸間的神經(jīng)傳遞［21］。

GAP-43屬于細胞內(nèi)膜相關(guān)蛋白，主要表達于神經(jīng)生長的帽狀結(jié)構(gòu)，參與了軸突生長、突觸形成、突觸重塑和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等［22］，GAP-43表達與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、突觸可塑性和神經(jīng)再生密切相關(guān)，在導向軸突生長和調(diào)節(jié)軸突形成過程中起到重要作用［23］。突觸形成后，GAP-43表達一般是下調(diào)的，本研究發(fā)現(xiàn)兩組動物之間海馬組織中GAP-43表達未見明顯變化，可能與CCH病理發(fā)生過程中動物自身的調(diào)節(jié)和補償機制有關(guān)［20］。

綜上所述，本研究所建立的動物模型屬于一種慢性非梗塞性腦缺血，可導致動物的認知功能障礙，模型組動物海馬組織中MAP-2和突觸素表達下調(diào)可能是導致動物認知功能損害的一種因素。

參考文獻

［1］Aliev G，Gasimov E，Obrenovich ME，etal.Atherosclerotic lesions and mitochondria DNA deletions in brain microvessels:implication in the pathogenesis of Alzheimer＇s disease［J］.Vasc Health Risk Manag，2008，4(3):721-730.

［2］Hasumi T，F(xiàn)ukushima T，Haisa T，etal.Focal dural arteriovenous fistula(DAVF)presenting with progressive cognitive impairment including amnesia and alexia［J］.Intern Med，2007，46(16):1317-1320.

［3］Sarti C，Pantoni L，Bartolini L，etal.Cognitiveimpairment and chronic cerebral hypoperfusion:what can be learned from experimental models［J］.J Neurol Sci，2002，203-204:263-266.

［4］Kruyt ND，Nys GM，van der Worp HB，etal.Hyperglycemia and cognitive outcome after ischemic stroke［J］.J Neurol Sci，2008，270(1-2):141-147.

［5］Tsuda Y，Yamada K，Hayakawa T，etal.Cortical blood flow and cognition after extracranial-intracranial bypass in a patient with severe carotid occlusive lesions.A three-year follow-up study［J］.Acta Neurochir(Wien)，1994，129(3-4):198-204.

［6］Silva AJ.Molecular and cellular cognitive studies of the role of synaptic plasticity in memory［J］.J Neurobiol，2003，54(1):224-237.

［7］Kudo T，Tada K，Takeda M，etal.Learning impairment and microtubule-associated protein 2 decrease in gerbils under chronic cerebral hypoperfusion［J］.Stroke，1990，21(8):1205-1209.

［8］Hai J，Ding M，Guo Z，etal.A new rat model of chronic cerebral hypoperfusion associated with arteriovenous malformations［J］.J Neurosurg，2002，97(5):1198-1202.

［9］Morris R.Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat［J］.JNeurosci Methods，1984，11(1):47-60.

［10］Schenk F，Morris RG.Dissociation between components of spatial memory in rats after recovery from the effects of retrohippocampal lesions［J］.Exp Brain Res，1985，58(1):11-28.

［11］ Meyer B，Schaller C，F(xiàn)renkel C，etal.Distributions of local oxygen saturation and its response to changes of mean arterial blood pressure in the cerebral cortex adjacent to arteriovenous malformations［J］.Stroke，1999，30(12):2623-2630.

［12］Hai J，Lin Q，Li ST，etal.Chronic cerebral hypoperfusion and reperfusion injury of restoration of normal perfusion pressure contributes the neuropathological changes in rat brain［J］.Mol Brain Res，2004，126(2):137-145.

［13］ Al-Shahi R，Warlow C.A systematic review of the frequency and prognosis of arteriovenous malformations of the brain in adults［J］.Brain，2001，124(10):1900-1926

［14］Spetzler RF，Wilson CB，Weinstein P，etal.Normal perfusion pressure breakthrough theory［J］.Clin Neurosurg，1978，25:651-672.

［15］Morgan MK，Anderson RE，Sundt TM Jr.A model of the pathophysiology of cerebral arteriovenous malformations by a carotid-jugular fistula in the rat［J］.Brain Res，1989，496(1-2):241-250.

［16］ Hai J，Li ST，Lin Q，Pan QG，etal.Vascular endothelial growth factor expression and angiogenesis induced by chronic cerebral hypoperfusion in rat brain［J］.Neurosurgery，2003，53(4):963-972.

［17］Hai J，Wan JF，Lin Q，Wang F，etal.Cognitive dysfunction induced by chronic cerebral hypoperfusion in a rat model associated with arteriovenous malformations［J］.Brain Res，2009，1301:80-88.

［18］ Tucker RP.The roles of microtubule-associated proteins in brain morphogenesis:a review［J］.Brain Res Brain Res Rev，1990，15(2):101-120.

［19］Dawson DA，Hallenbeck JM.Acute focal ischemia-induced alterations in MAP2 immunostaining:description of temporal changes and utilization as a marker for volumetric assessment of acute brain injury［J］.JCereb Blood Flow Metab，1996，16(1):170-174.

［20］ Liu HX，Zhang JJ，Zheng P，etal.Altered expression of MAP-2，GAP-43，and synaptophysin in the hippocampus of rats with chronic cerebral hypoperfusion correlates with cognitive impairment［J］.Brain Res Mol Brain Res，2005，139(1):169-177.

［21］ Ding Y，Li J，Clark J，etal.Synaptic plasticity in thalamic nuclei enhanced by motor skill training in rat with transient middle cerebral artery occlusion［J］.Neurol Res，2003，25(2):189-194.

［22］Strittmatter SM，Vartanian T，F(xiàn)ishman MC.GAP-43 as a plasticity protein in neuronal form and repair［J］.J Neurobiol，1992，23(5):507-520.

［23］Xiao N，Li S，Zhang X，etal.Effect of ephedrine on neuronal plasticity of hypoxic-ischemic brain damage in neonatal rats［J］.Neurosci Lett，2008，435(2):99-102.