王海雁，常華，胡雅琴，楊維芳，馮鋒

（1.山西大同大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山西 大同 037009；2.國藥集團(tuán)大同威奇達(dá)中抗制藥有限公司，山西大同經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)，山西 大同 037000）

0 引言

我國是世界青霉素原料藥生產(chǎn)大國，山西大同地區(qū)由于其得天獨(dú)厚的日照時間長、空氣干燥等氣候條件，成為全國主要的青霉素原料藥生產(chǎn)基地.6－氨基青霉烷酸（6－Aminopenicillanic acid，6－APA），結(jié)構(gòu)式見圖1A，是制備半合成頭孢菌素如氨芐青霉素、阿莫西林、羥氨芐青霉素、唑酮氨芐青霉素、硫苯咪唑青霉素、磺唑氨芐青霉素等的主要母核.6－APA終產(chǎn)品中苯乙酸（結(jié)構(gòu)式見圖1B）的含量是評價6－APA品質(zhì)的一個重要標(biāo)準(zhǔn).6－APA終產(chǎn)品中苯乙酸的質(zhì)量百分比必須低于0.1%，否則直接影響下游產(chǎn)品質(zhì)量.目前已有的苯乙酸的分析方法，主要是針對6－APA生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制，終產(chǎn)品中苯乙酸等雜質(zhì)的單獨(dú)測定則需要復(fù)雜的樣品前處理過程［1－6］.

基于《中國藥典》2010年版檢測6－APA的標(biāo)準(zhǔn)HPLC方法［7］，本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC的苯乙酸加標(biāo)檢測法，能夠直接測定6－APA終產(chǎn)品中的6－APA及殘留苯乙酸的含量.該方法符合國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)［8］，且不需要柱前預(yù)處理.與現(xiàn)行梯度洗脫測定苯乙酸含量的方法相比，操作簡便、快速，且精密度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性均符合國標(biāo)要求.

圖1 6－APA、苯乙酸的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Constitutional formulas of 6－APA and Phenylacetic Acid

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 主要儀器和試劑

高效液相色譜儀（Agilent 1260，美國），紫外分光光度計（島津UV－1601，日本），100mm×4.6mm，5μm ODS－2C18色譜柱（Hypersil，美國）.

KH2PO4（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），Na2HPO4（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），6－APA終產(chǎn)品（批號1205179，含水分0.043%，國藥集團(tuán)大同威奇達(dá)藥業(yè)中抗有限公司提供），6－APA標(biāo)準(zhǔn)品（批號 WS2012001，含量99.4%），苯乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號 WS2012002，含量99.19%），實(shí)驗(yàn)用水均為純化水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在2010年版檢測6－APA的標(biāo)準(zhǔn)HPLC方法［7］基礎(chǔ)上結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室條件加以優(yōu)化.流動相A為pH＝7.00的磷酸鹽緩沖溶液，流動相B為乙腈.檢測波長選擇220nm，柱溫是25℃，流量為1mL／min，進(jìn)樣量為20μL.

依據(jù)6－APA樣品中苯乙酸色譜峰的保留時間和峰面積定量計算苯乙酸的含量.為了精確鑒別色譜圖中微量苯乙酸的出峰位置，參照文獻(xiàn)中檢測物加標(biāo)分析法［8］，將已知濃度的苯乙酸標(biāo)準(zhǔn)液在測試前加入到樣品溶液中一同進(jìn)樣，與未加標(biāo)準(zhǔn)品的樣品溶液的色譜圖相比較，該色譜圖中苯乙酸的峰面積會明顯增加，即可精確確認(rèn)實(shí)際樣品中苯乙酸峰的位置，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其含量.這是一種簡單快速的定量定位法.

精確稱量苯乙酸標(biāo)準(zhǔn)品、6－APA標(biāo)準(zhǔn)品適量，用流動相A溶解并稀釋.配制苯乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液的濃度為0.1526mg／mL，苯乙酸標(biāo)準(zhǔn)對照液濃度為其標(biāo)準(zhǔn)儲備液質(zhì)量濃度的1%，用于精密度試驗(yàn)的苯乙酸標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度為2.250×10－3mg／mL；配制6－APA標(biāo)準(zhǔn)儲備液的濃度為3.00mg／mL，6－APA標(biāo)準(zhǔn)對照液的濃度為其標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度的1%.配制苯乙酸和6－APA混合標(biāo)準(zhǔn)對照液中苯乙酸與6－APA的濃度與其標(biāo)準(zhǔn)對照液相同，分別為1.526×10－3mg／mL、3.00×10－2mg／mL.4℃條件下貯藏.

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

分別取空白輔料溶液、苯乙酸標(biāo)準(zhǔn)對照液、6－APA標(biāo)準(zhǔn)對照液、苯乙酸和6－APA混合標(biāo)準(zhǔn)對照液，以及6－APA終產(chǎn)品作為供試品溶液，按以上條件測定.得到6－APA和苯乙酸的保留時間分別為3.886min和6.372min（圖2）.苯乙酸和6－APA分離完全，分離度為10.05，大于1.5；6－APA的理論塔板數(shù)為4793，不低于1500，拖尾因子為0.86，不高于2.5，符合國標(biāo)［9］.

圖2 苯乙酸和6－氨基青霉烷酸混合標(biāo)準(zhǔn)對照液的色譜圖Fig.2 Chromatograms of standard solution of 6－aminopenicillanic acid and phenvacetic acid

2.2 線性范圍

以峰面積A為縱坐標(biāo)，苯乙酸的濃度C為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性分析，得到苯乙酸對照標(biāo)準(zhǔn)品溶液在0.3022～3.022×10－3mg／mL濃度范圍內(nèi)其濃度C與峰面積A 呈良好的線性關(guān)系，線性方程Y＝38.74 X＋0.2637，相關(guān)系數(shù)為0.9998.

2.3 檢測限及精密度實(shí)驗(yàn)

流動相A逐級稀釋苯乙酸標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液10倍、100倍、1000倍、10000倍.分別過濾，注入Agilent樣品瓶中，按色譜條件測定，記錄色譜圖，量取峰面積.結(jié)果表明：當(dāng)信噪比（S／N）為3／1時，溶液的濃度為0.0153×10－3mg／mL，苯乙酸對照品溶液的檢測限為15.26ng／mL（RSD＝0.82%）.

苯乙酸標(biāo)準(zhǔn)使用液注入Agilent樣品瓶中，按色譜條件測定，記錄色譜圖，量取峰面積，連續(xù)進(jìn)樣6次.該試驗(yàn)得出6次進(jìn)樣所得峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.82%，小于2.0%，可用于6－APA樣品中苯乙酸含量的測定.

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

過濾苯乙酸標(biāo)準(zhǔn)對照液，注入Agilent樣品瓶中，分別于0h，1h，2h，3h，4h，5h進(jìn)樣.按色譜條件測定，記錄色譜圖，量取峰面積.穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD＜2%，表明本實(shí)驗(yàn)條件下，樣品在25℃條件下5h內(nèi)穩(wěn)定，儀器的穩(wěn)定性良好，可以滿足6－APA樣品中苯乙酸含量的測定［9］.

2.5 加標(biāo)苯乙酸的回收率實(shí)驗(yàn)

取3批苯乙酸含量已知的6－APA樣品，如表1所示精確稱取樣品量，置于100mL的容量瓶中，并平行加入1.0mL苯乙酸儲備液，用流動相A溶解并稀釋至刻度，搖勻、過濾，取濾液，注入Agilent樣品瓶中，按色譜條件進(jìn)行測定.測定結(jié)果見表1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)回收率在80%～120%范圍內(nèi)，可以滿足6－APA樣品中苯乙酸含量的測定［9］.

2.6 終產(chǎn)品樣品分析

實(shí)際樣品分析時，按照試驗(yàn)方法對不同批號的6－APA終產(chǎn)品樣品進(jìn)行加標(biāo)處理并測定.結(jié)果見表2.樣品分析結(jié)果表明，由該方法測得的樣品中苯乙酸的含量略小于由梯度洗脫測得的結(jié)果，但均符合國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（0.1%）.

表1 苯乙酸回收實(shí)驗(yàn)Table 1 Recovery test of standard Phenethyl acid

表2 終產(chǎn)品中苯乙酸測定Table 2 Analysisi of phenethyl acid in real samples

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜法加苯乙酸標(biāo)準(zhǔn)品檢測6－APA樣品中殘留苯乙酸含量的方法.應(yīng)用本方法，6－APA、苯乙酸分離完全，線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.9998.對樣品不需要進(jìn)行柱前預(yù)處理，不僅節(jié)省了時間，提高了效率，而且所得的測量結(jié)果，準(zhǔn)確度與精密度都符合要求，分析結(jié)果令人滿意.總體來說，本文所用方法快速便捷，而且準(zhǔn)確度、分離度、重現(xiàn)性都能達(dá)到要求，完全適用于終產(chǎn)品中6－APA和殘留苯乙酸含量的直接測定.

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［4］趙國芬，尹翠英，王洪濤.6－APA中殘余苯乙酸、青霉素 G含量的測定［J］.石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2008，20（4）：15－17.

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［6］師學(xué)娟，蘇大偉，劉煥姿，等.高效液相色譜法測定6－APA 的相關(guān)物質(zhì)［J］.河北化工，2011，34（12）：20－22.

［7］《中國藥典》2010年版二部附錄 Ⅳ［S］.

［8］Wang H Y，Lee W M A，Shuang S M，et al.SPE／HPLC／UV Studies on Acrylamide in Deep－fried Flour－based Indigenous Chinese Foods［J］.Microchemical Journal，2008，89：90－97.

［9］國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn) WSI－（X－046）－2005Z［S］.