沈文華，陳 業(yè)，李婭迪，江 輝，關(guān) 萍

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025)

唇形科(Lamiaceae)是雙子葉植物綱中的一個(gè)大科，大約有220屬3 500余種，中國(guó)約有98屬800余種，全國(guó)廣布;貴州有47屬127種［1］。中國(guó)唇形科藥用植物共有74屬345余種，其中《中藥大辭典》收錄的共41屬120余種［2］，常見的唇形科藥用植物有益母草、牛至、夏枯草、筋骨草、藿香、紫蘇、薄荷、荊芥、黃芩等［3］。唇形科植物只有在花果期時(shí)才便于鑒定，且屬內(nèi)不同種相似性較大，種質(zhì)鑒定極其不易，作為藥材時(shí)，經(jīng)常有奸商將偽品魚目混珠［4］。DNA條形碼(DNA barcoding)作為一種快速、有效而標(biāo)準(zhǔn)化的分子鑒定方法，由加拿大U-niversity of Guelph動(dòng)物學(xué)家Paul Hebert首次提出［5］。Kress等［6］最早將 ITS 作為植物 DNA 條形碼候選片段，目前已有在七葉一枝花［7］、柴胡［8］、黃草石斛［9］等中藥材方面的研究。本文對(duì)常見唇形科植物ITS-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為唇形科藥用植物的分子鑒定奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的16種唇形科植物均于2012年6月至9月采于貴陽(yáng)市花溪區(qū)，由貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院關(guān)萍教授鑒定(表現(xiàn)1)。

1.2 基因組DNA的提取與檢測(cè)

采用改良的CTAB法［10］提取全基因組DNA，0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，通過(guò)紫外分光光度計(jì)確定DNA濃度與純度，并將濃度稀釋至20～80 ng/μL。

表1 研究材料Tab.1 The materials used for PCR reaction system optimization

1.3 正交設(shè)計(jì)與各反應(yīng)因素水平確定

益母草nrDNA ITS片段的擴(kuò)增采用通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和 ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)［11］。以益母草DNA為模板，選用L9(34)正交表(表2)，對(duì)Taq聚合酶、Mg2+、dNTP及引物的濃度進(jìn)行篩選。反應(yīng)體系總體積為25μL，每管加入2.5μL的10×PCR buffer和1μL模板DNA，加去離子水補(bǔ)足，每組處理重復(fù)兩次。

表2 PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表［L 9(34)］Tab.2 Orthogonal design for PCR amplification

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-Rad梯度PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?94℃ 4 min;94℃ 1 min;54℃45 s;72℃ 1 min;35次循環(huán);72℃最后延伸7 min，擴(kuò)增完成后4℃保存。用1.5%的瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)成像。

依據(jù)桂騰琴等［12］的方法對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果依次打分，采用正交設(shè)計(jì)助手ⅡV3.1與MINITAB軟件對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行直觀分析與分差分析，依據(jù)方差分析的結(jié)果確定是否需要進(jìn)行多重比較分析。

根據(jù)試驗(yàn)分析結(jié)果，選擇最佳反應(yīng)體系對(duì)退火溫度進(jìn)行梯度試驗(yàn)，設(shè)定 50.0、50.7、51.9、53.6、55.6、57.2、58.4、59.0℃8 個(gè)溫度梯度，每個(gè)梯度設(shè)兩個(gè)重復(fù)，最后用最佳反應(yīng)體系與程序?qū)?6種唇形科植物進(jìn)行ITS-PCR穩(wěn)定性驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS－PCR正交設(shè)計(jì)直觀分析

正交試驗(yàn)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。綜合考慮兩次重復(fù)的擴(kuò)增結(jié)果，條帶最清晰、穩(wěn)定的組合計(jì)9分，最差的計(jì)1分，9個(gè)組合的分?jǐn)?shù)依次為3、4、8、5、6、9、2、1、7，再根據(jù)打分，采用正交設(shè)計(jì)助手ⅡV3.1進(jìn)行直觀分析(表3)。極差值R反應(yīng)了影響因素對(duì)反應(yīng)體系的影響，R越大，影響越顯著。由表3可知，各因素水平的變化對(duì)反應(yīng)體系的影響從大到小依次為:Mg2+＞Taq＞dNTP＞引物。

圖1 正交試驗(yàn)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of orthogonal design PCR products The codes of lane

表3 正交設(shè)計(jì)直觀分析Tab.3 Intuitive analysis of orthogonal design

依據(jù)每個(gè)因素水平下的均值ki，直觀分析得出的最佳反應(yīng)體系為:1.5 U Taq聚合酶;2.0 mmol/L Mg2+;0.15 ～0.20 mmol/L dNTP;引物濃度為 0.4 μmol/L。直觀分析得出的最佳反應(yīng)體系并沒(méi)有在正交表中表現(xiàn)出，雖然與得分最高的6號(hào)組合在引物用量上有差別，但其ki值相差并不是很大。

2.2 正交設(shè)計(jì)方差分析

用正交設(shè)計(jì)助手ⅡV3.1軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析(表4)。由F比值可知，Mg2+濃度各水平對(duì)PCR結(jié)果的影響最大，其次是Taq聚合酶用量，而dNTP與引物量對(duì)PCR結(jié)果影響不明顯。

表4 正交設(shè)計(jì)方差分析Tab.4 Variance analysis of orthogonal design

用MINITAB軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多重比較分析(圖2)，結(jié)果表明，Mg2+濃度對(duì)該試驗(yàn)結(jié)果的影響最大。Mg2+濃度在 1.0、1.5 mmol/L 水平間的差異不明顯，但與2.0 mmol/L水平的差異顯著(圖2)。圖 1 中，當(dāng) Mg2+濃度為1.0 mmol/L(1、4、7 號(hào)處理)時(shí)和1.5 mmol/L(2、5、8 號(hào)處理)時(shí)，臨近處理號(hào)PCR產(chǎn)物條帶相似，擴(kuò)增條帶弱、有雜帶，且彌散、拖尾;當(dāng) Mg2+濃度為 2.0 mmol/L(3、6、9 號(hào)處理)時(shí)，擴(kuò)增條帶亮度清晰、明亮，無(wú)雜帶，彌散與拖尾現(xiàn)象減弱或者消失。因此，選擇2.0 mmol/L為最佳水平。

Taq聚合酶用量對(duì)PCR結(jié)果的影響僅次于Mg2+用量，各水平間均有顯著差異，說(shuō)明在本試驗(yàn)所選梯度范圍內(nèi)Taq聚合酶用量對(duì)PCR反應(yīng)結(jié)果影響較大，最佳用量為1.5 U。

dNTP濃度在該試驗(yàn)選取的3個(gè)水平范圍內(nèi)對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果影響不顯著，這一結(jié)論與馬大龍等［13］的研究相似，參照ki值以及從經(jīng)濟(jì)角度考慮，最佳dNTP濃度為0.15 mmol/L。

在本試驗(yàn)所選的3個(gè)水平范圍內(nèi)，引物濃度對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響也不顯著，這與陳業(yè)等［14］的研究相似，參照每一因素水平下的數(shù)據(jù)平均值ki，最佳引物濃度為1.0μmol/L。

圖2 各因素與實(shí)驗(yàn)結(jié)果主效應(yīng)圖Fig.2 The main effect pattern of each factor and experiment result

2.3 退火溫度對(duì)益母草ITS－PCR擴(kuò)增的影響

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，選擇的反應(yīng)體系為:1.5 U Taq 聚合酶，2.0 mmol/L Mg2+，0.15 mmol/L dNTP，0.4μmol/L引物。依據(jù)引物Tm值，以此體系進(jìn)行溫度梯度試驗(yàn)(圖3)。由圖3可見，退火溫度較高時(shí)(55.6、57.2、58.4、59℃)，擴(kuò)增條帶較弱，且雜帶較多;退火溫度較低時(shí)(50℃)，擴(kuò)增條帶雖然清晰、明亮，但主帶附近有1條明顯的雜帶;退火溫度50.7～53.6℃都能擴(kuò)增出單一明亮的條帶。由于適當(dāng)提高退火溫度可提高擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，故選擇53.6℃為最佳退火溫度。

圖3 退火溫度對(duì)ITS反應(yīng)的影響Fig.3 The effect of annealing temperature on ITSamplification Lane 1 to 8 indicating the annealing temperature

2.4 最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的驗(yàn)證

根據(jù)正交試驗(yàn)及溫度梯度擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)唇形科16種植物進(jìn)行反應(yīng)體系的驗(yàn)證。反應(yīng)程序?yàn)?第一階段，94℃預(yù)變性4 min;第二階段，94℃變性 1 min，53.6℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，循環(huán) 35次;第三階段，72℃延伸7 min，反應(yīng)終止，4℃保存。PCR擴(kuò)增后進(jìn)行電泳檢測(cè)出現(xiàn)清晰、明亮的單一譜帶(圖4)，產(chǎn)物經(jīng)上海生工測(cè)序，除10以外都獲得了ITS序列。

圖4 16種常見唇形科植物ITS擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Electrophoresis of 16 common lamiaceae PCR products

3 討論

已有研究報(bào)道［10-12］表明，PCR反應(yīng)對(duì)模板濃度要求范圍較寬，故本試驗(yàn)未對(duì)模板濃度進(jìn)行探究。試驗(yàn)結(jié)果表明，在ITS擴(kuò)增反應(yīng)體系中，Taq聚合酶、Mg2+對(duì)擴(kuò)增結(jié)果有重要影響，而dNTP、引物濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響不明顯。在PCR反應(yīng)體系中，Mg2+濃度過(guò)高，會(huì)使反應(yīng)特異性降低，濃度過(guò)低，使產(chǎn)物產(chǎn)量減少;Taq聚合酶濃度太高，會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，而過(guò)低時(shí)則擴(kuò)增產(chǎn)量太低。同時(shí)，為增加試驗(yàn)的可比性，應(yīng)盡量選擇同一產(chǎn)家同一批次的Taq聚合酶。dNTP與引物濃度對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果都有影響，dNTP濃度過(guò)低影響擴(kuò)增產(chǎn)量，過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤摻入，而引物濃度過(guò)高則有兩個(gè)弊端:一是容易形成引物二聚體，二是微量靶目標(biāo)并且起始材料又不太純時(shí)容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。本試驗(yàn)dNTP與引物濃度的3個(gè)水平對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響不明顯，僅表明這3個(gè)水平對(duì)本試驗(yàn)的影響。因此，不同植物初建ITS-PCR體系時(shí)，要保證擴(kuò)增結(jié)果的穩(wěn)定性、可信性、重復(fù)性，必須對(duì)ITS擴(kuò)增的條件與因素進(jìn)行優(yōu)化。

本試驗(yàn)將正交設(shè)計(jì)應(yīng)用于PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化中，并在結(jié)果分析中應(yīng)用了正交設(shè)計(jì)助手、MINITAB軟件。與單因素設(shè)計(jì)和完全組合設(shè)計(jì)相比具有以下優(yōu)勢(shì):減少了處理組合，節(jié)省了人力財(cái)力;將結(jié)果量化，使結(jié)果更標(biāo)準(zhǔn)、完善、科學(xué)，具有一定的客觀準(zhǔn)確性;試驗(yàn)中各因素內(nèi)水平間的相關(guān)性分析結(jié)合圖表，其規(guī)律一目了然。本試驗(yàn)中對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果打分帶有一定的主觀性，打分結(jié)果可能出現(xiàn)因人而異的情況，因此，可采取多次打分取平均值的方法以削弱誤差的影響，同時(shí)需建立一套客觀、標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)價(jià)準(zhǔn)則。

本試驗(yàn)獲得的最佳反應(yīng)體系經(jīng)過(guò)論證，可以為后續(xù)唇形科植物ITS-PCR反應(yīng)提供參考。對(duì)于樣品10，可以適當(dāng)提高M(jìn)g2+濃度，或者結(jié)合單因素試驗(yàn)對(duì)Mg2+濃度進(jìn)行優(yōu)化，以獲得ITS序列。

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