孫鳳杰， 任建兵， 黃 曉， 吳 瑕， 李 艷， 楊雪松， 柳國勝△

(暨南大學 1附屬第一醫(yī)院新生兒科， 2醫(yī)學院組織與胚胎學系，廣東 廣州 510632)

GATA-4在妊娠期糖尿病胎鼠心臟中的表達*

孫鳳杰1， 任建兵1， 黃 曉1， 吳 瑕1， 李 艷2， 楊雪松2， 柳國勝1△

(暨南大學1附屬第一醫(yī)院新生兒科，2醫(yī)學院組織與胚胎學系，廣東 廣州 510632)

目的了解妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)胎鼠心臟發(fā)育過程中鋅指轉錄因子GATA結合蛋白4(GATA binding protein 4, GATA-4)的變化規(guī)律，為深入探討其在GDM胎鼠心臟發(fā)育異常中的作用機制奠定基礎。方法80只SPF級成年SD雌鼠隨機分為對照組(n=40)和GDM組(n= 40)，通過陰道涂片確定受孕后，GDM 組予腹腔注射2%鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ;每只40 mg/kg)，對照組予腹腔注射等量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。給藥72 h后每天監(jiān)測血糖，各組分別于孕12、15、19 d剖取胎鼠心臟組織，HE染色觀察心臟組織病理變化，免疫組化檢測GATA-4的表達，實時熒光定量RT-PCR檢測GATA-4 mRNA的表達，Western blotting檢測GATA-4蛋白的變化。結果對照組及GDM組GATA-4蛋白的表達呈動態(tài)變化：孕12 d可見表達，孕15 d表達最高，孕19 d表達下降；與對照組相比，GDM組GATA-4 mRNA及蛋白的表達呈現下降趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論妊娠期糖尿病胎鼠心臟發(fā)育異常率顯著增高，GATA-4與GDM胎鼠心臟發(fā)育異?？赡苡邢嚓P性。

GATA結合蛋白4； 妊娠期糖尿病； 心臟發(fā)育

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)發(fā)病率呈現逐年增高的趨勢，已成為備受關注的公共健康問題之一。GDM可致胎兒發(fā)育異常如巨大兒、死胎、先天畸形等，其中GDM胎兒心臟畸形發(fā)生率較高，嚴重影響患兒的生存質量[1-2]。

鋅指轉錄因子GATA結合蛋白4(GATA binding protein 4, GATA-4)作為與心臟發(fā)育密切相關的調控因子之一，是心臟形成過程中的一個劑量敏感型調控子[3]，該基因突變可致基因產物的轉錄活性下降，并影響其它心臟發(fā)育相關因子發(fā)揮作用，進而導致先天性心臟??；GATA-4亦是啟動心肌細胞分化發(fā)育過程的關鍵因子之一[4]。但目前就GATA-4與GDM胚胎心臟發(fā)育異常關系的報道較為少見，因此本研究旨在了解GDM胎鼠心臟發(fā)育過程中GATA-4表達的變化規(guī)律，為深入探討其在GDM胎鼠心臟發(fā)育異常中的作用機制奠定基礎。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 SPF級健康成年SD雌鼠80只、體質量(220±20)g，SD雄鼠25只、體質量(300±20)g，購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心，實驗動物許可證號為SCXK (粵) 2008-0002，粵監(jiān)證字為2008A020。

1.2主要試劑 鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)購自Sigma；GATA-4抗體購自Santa Cruz；Trizol提取液購自Invitrogen；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa；HRP標記的GAPDH優(yōu)質內參購自上海康成生物公司；蛋白樣品初步定量采用南京凱基生物發(fā)展有限公司提供的試劑盒(型號為KGPBCA)；其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

2方法

2.1實驗分組及建立GDM模型鼠 將SD鼠適應性飼養(yǎng)1周，均給予正常飲食飲水，按晝夜規(guī)律控制光線，每天更換墊料，稱量體重、檢測血糖(血糖≥7.0 mmol/L者剔除，本實驗中尚無剔除者)并編號。取SD雌鼠與雄鼠(雌雄比例為3∶1)合籠過夜后次晨將雌鼠行陰道分泌物涂片、鏡檢，發(fā)現精子者記為妊娠0 d，標記孕鼠并計算孕期，進行隔離喂養(yǎng)，隨機分為對照組和GDM組。

GDM組：將鏡檢發(fā)現精子的雌鼠空腹8 h后，采用0.1 mol/L、pH 4.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制成2% STZ新鮮溶液，按每只40 mg/kg單側腹腔注射，4 h后給予正常飲食，72 h后測定血糖并稱量體重；若血糖≥ 8.12 mmol/L納入該組[5]。對照組：按照上述方法注射等量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液作為對照研究。 再次將對照組及GDM組孕鼠依據剖宮日期隨機分為孕12、15、19 d 3個亞組。

2.2標本收集及樣本制備 給藥72 h后每天檢測孕鼠血糖及體重，各組分別于孕12、15、19 d隨機剖宮，觀察孕鼠流產情況，檢查胎鼠的外部形態(tài)(包括活胎、死胎及吸收胎等)，稱量胎鼠體重并取材。

2.3蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosion,HE)染色 采用4%多聚甲醛溶液固定各實驗分組之心臟組織，常規(guī)脫水及石蠟包埋，制備成3 μm連續(xù)切片后行HE染色，光鏡下觀察各組胎鼠心臟組織的病理學改變。

2.4免疫組化檢測胎鼠心臟組織GATA-4蛋白的表達 將石蠟包埋的心臟組織進行脫蠟處理、組織抗原修復，依據鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(streptavidin-peroxidase conjunction method, S-P法)操作說明書處理，DAB染色、蘇木素復染、脫水、中性樹膠封固，拍照保存并運用Image-Pro Plus 6.0行圖像分析。

2.5胎鼠心臟組織GATA-4 mRNA測定 采用Trizol法抽提胎鼠心臟組織總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA的純度及濃度，要求A260/A280=1.8～2.0，根據所測RNA的濃度值，調整每管RNA的濃度以備下一步反轉錄使用；按逆轉錄試劑盒說明書方法，逆轉錄合成第1條cDNA；以β-actin為內參照，采用實時熒光定量RT-PCR進行GATA-4和β-actin產物擴增及結果分析。登陸GenBank ( http://ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/fulltext.htlm)庫獲得GATA-4及β-actin cDNA序列(GATA-4: NM-144730.1;β-actin: NM-007393)，引物由廣州英駿生物科技有限公司合成。GATA-4上游引物5’-TCTTGACTGAGTTCTGGGCATC-3’，下游引物5’-GCAACAATCTTTAGGCTCTGGT-3’；β-actin上游引物5’-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3’，下游引物5’-CCCATACCCACCATCACACC-3’。采用兩步法PCR擴增標準程序，在其它條件不變的情況下以2 ℃為溫度梯度遞增，在53～63 ℃區(qū)間內進行退火溫度的優(yōu)化，在PCR擴增后進行熔解曲線分析，為消除加樣誤差，每管設3個復孔。通過檢測Ct值的結果進行相對定量，采用GATA-4的Ct值減去內參β-actin的Ct值得到ΔCt，GDM組與對照組的基因表達相對定量用2-ΔΔCt表示，其意義是GDM組與對照組GATA-4 mRNA表達的倍比關系，其中ΔΔCt=ΔCtGDM組-ΔCt對照組，將上述方法所得數據行統(tǒng)計學分析。

2.6胎鼠心臟組織GATA-4蛋白測定 取胎鼠心臟組織約100 mg，冰上操作加500 μL RIPA裂解液(含PMSF和Cocktail)于勻漿器中反復碾碎并離心以提取總蛋白；依據試劑盒說明書對蛋白樣品初步定量，取含蛋白10 μL的溶液體積為上樣量，加入樣品處理液，煮沸5 min,SDS-PAGE電泳120 min轉至PVDF膜后，室溫下用5%脫脂奶粉(脫脂奶粉+TBST)封閉1 h；洗膜后加I抗，室溫孵育4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次5 min；加II抗，室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，每次5 min；將化學熒光發(fā)光底物均勻地加到膜的表面，且反應持續(xù)5 min；去除膜表面的殘液，置于曝光盒中曝光、顯影、定影；采用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶灰度值并行統(tǒng)計學分析。

3統(tǒng)計學處理

數據采用SPSS 13.0行統(tǒng)計學分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組內各時點采用單因素方差分析并做兩兩比較；同一時點GDM組和對照組之間采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1對照組與GDM組胎鼠心臟發(fā)育畸形的比較

與對照組相比較，各時點中GDM組胎鼠心臟發(fā)育異常發(fā)生率增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 對照組與GDM組胎鼠心臟畸形例數的比較

△P<0.05vscontrol group at the same time point.

2各組胎鼠心臟組織病理變化

對照組：胎鼠發(fā)育至第12 d房間孔已基本發(fā)育完全，部分與心內膜墊之間存有室間孔；至第15 d室間隔膜部形成，心房壁上出現肌小梁結構、心室壁增厚；第19 d心房心室壁繼續(xù)增厚，肌小梁增多、增粗。同一時點對照組心臟大小勻稱、心室規(guī)整、各瓣膜未見明顯異常；高倍鏡下可見心肌細胞呈橢圓形、排列整齊且肌漿豐富，位于細胞中央的細胞核呈圓形或橢圓形且染色均勻，見圖1。

Figure 1. The changes of fetal cardiac tissues on E12, E15 and E19 in control and GDM groups (HE staining, ×25). A, B, C: control group on E12, E15 and E19, respectively; D: GDM group on E12, truncus arteriosus communis; E: GDM group on E15, interventricular septum rupture; F: GDM group on E19, myocardial hypertrophy.

圖1對照組和GDM組孕12、15和19d胎鼠心臟組織的變化

GDM組：畸心胎數目較多,胚胎第12 d可見動脈單干等圓錐干發(fā)育畸形；胚胎第15 d有室間隔缺損及室間隔裂等病變；至第19 d可見心肌壁肥厚等畸形。高倍鏡下可見心肌細胞結構紊亂伴水腫及壞死，成片的無結構區(qū)、胞漿溶解、胞核形態(tài)不規(guī)則且大小不一伴染色不均，見圖1。

3免疫組化檢測各組胎鼠心臟組織GATA-4蛋白的表達

GATA-4蛋白的表達呈現動態(tài)變化，胚胎第12 d表達于心房、心室的心肌細胞等部位；胚胎第15 d在房、室間隔等處的心肌、心內膜及瓣膜處表達較明顯；胚胎第19 d仍表達于以上部位但表達不明顯，見圖2。在同一時點GDM組GATA-4的表達較對照組下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

Figure 2. The expression of GATA-4 on E12, E15 and E19 in control and GDM groups (immunohistochemical staining, ×200). A, B, C: control group on E12, E15 and E19, respectively; D, E, F: GDM group on E12, E15 and E19, respectively. Compared with control group on E12, E15 and E19, the expression of GATA-4 in GDM group deceased at the same time points.

圖2對照組和GDM組孕12、15和19d胎鼠心臟組織GATA-4的表達

表2免疫組化檢測胎鼠心臟組織GATA-4蛋白的表達

Table 2. The expression of GATA-4 protein in cardiac tissues of fetal mice detected by immunohistochemistry (mean±SD.n=9)

GroupE12E15E19Control1．15±0．011．53±0．09★0．92±0．06GDM0．84±0．07▲1．28±0．04▲★0．71±0．02▲

▲P<0.05vscontrol group at the same time point;★P<0.05vsthe same group on E12 and E19.

4各組胎鼠心臟組織GATA-4mRNA的表達水平

與對照組相比較，各時點的GDM組胎鼠心臟組織GATA-4 mRNA表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

5各組胎鼠心臟組織GATA-4蛋白的表達變化

Western blotting檢測結果顯示,各組胎鼠心臟組織中均有GATA-4蛋白的表達，與對照組相比，各時點GDM組GATA-4蛋白表達均減少 (P<0.05)，見圖4。

Figure 3. Expression of GATA-4 mRNA in fetal mouse cardiac tissues from each group measured by real-time fluorescence quantitative RT-PCR．Mean±SD.n=9.△P<0.05vscontrol group at the same time point.

圖3實時熒光定量RT-PCR檢測各組胎鼠心臟組織GATA-4mRNA的表達

Figure 4. Expression of GATA-4 protein in fetal mouse cardiac tissues from each group measured by Western blotting. Mean±SD.n=3.△P<0.05vscontrol group at the same time point.

圖4各組胎鼠心臟組織GATA-4的表達

討 論

GDM是妊娠后首次發(fā)現或發(fā)病的糖尿病，糖尿病孕婦中80%以上為GDM[6]，其對孕母及胎兒均有不良影響，是發(fā)生胚胎期心血管畸形的病因之一。GDM發(fā)病機制尚未完全闡明，高血糖通過許多生物化學機制誘導損害，但尤以高血糖誘發(fā)線粒體活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產生[7]及細胞凋亡[8]為著；同時，GDM的發(fā)病也與遺傳及免疫因素等相關[9]。本實驗在采用2%STZ腹腔注射已受孕的SD雌鼠成功建立GDM模型鼠的基礎上，發(fā)現GDM組中吸收胎、死胎、畸心胎、巨大胎兒等發(fā)育異常例數較對照組明顯增高；GDM組胎鼠心臟發(fā)育異常(包括心室流出道梗阻、室間隔缺損及室間隔裂、肌壁肥厚、心腔擴大等)的發(fā)生率較對照組有明顯升高，與臨床資料中GDM孕母所致胎兒心臟發(fā)育異常之病理類型相符合[10]。

GATA-4貫穿于心臟發(fā)育的整個過程，是一個具有重要作用的轉錄因子，為心臟正常發(fā)育所必需，且調控許多心臟轉錄基因的表達，并通過其鋅指結構與其它心臟轉錄因子相互作用[11]。GATA-4作為心臟發(fā)育調控網絡的核心因子之一[12]，主要表達于胚胎期的心臟、性腺、肝臟和內胚層等，與其它因子協(xié)同控制著心原細胞的特異性分化、心臟祖細胞的遷移及心管的形成等，然而由GDM誘導的胎鼠心臟發(fā)育過程中GATA-4所發(fā)揮的作用尚未明確。

本實驗結果顯示：孕12 d、孕15 d、孕19 d GDM組及對照組胎鼠心臟中均可檢測到GATA-4的表達：孕12 d表達于心室和心房處的心肌細胞、心內膜墊、大動脈根部等，孕15 d表達有所上調且在房室間隔、瓣膜處等均可檢測到，孕19 d表達有所下降，表明GATA-4在胚胎心臟發(fā)育過程中呈現一個動態(tài)的變化過程，上述結果與以往的文獻報道相一致[13]。

Kobayashi等[14]研究發(fā)現：高血糖環(huán)境中大鼠心肌細胞表達的GATA-4蛋白含量明顯下降，同時由STZ所誘導的糖尿病模型鼠之心臟組織中發(fā)現GATA-4蛋白水平亦減少，過表達GATA-4有阻止高血糖所致的GATA-4降解及心肌細胞死亡的作用，提示GATA-4蛋白降解的增多可能為高血糖致心臟畸形的一個重要作用機制，心臟的GATA-4基因失活可誘發(fā)凋亡和心臟功能的損害。本實驗表明,與對照組相比較，孕12 d、孕15 d及孕19 d GDM模型鼠的mRNA水平呈下降趨勢且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；孕12 d、孕15 d及孕19 d GDM模型鼠GATA-4的蛋白水平較對照組下降(P<0.05)，提示高血糖環(huán)境中胚胎體內的GATA-4存在著質或量的改變，致使處于發(fā)育階段的心臟出現畸形改變。GATA-4是心臟發(fā)育過程中(尤其是早期階段)的重要轉錄因子，很多心臟結構基因序列中存在GATA-4結合位點，在原始心肌細胞中此結合位點對于增強子的活性是必需的。GATA-4是心臟形成過程中一個必需的劑量依賴性轉錄因子，胚胎的存活及心臟發(fā)育均需GATA-4表達于正常閾值的30%～50%范圍內，當GATA-4低于此水平時心肌細胞復制減少，引發(fā)心肌發(fā)育不全和心內膜墊缺損等畸形[3]。

GATA-4調控著多種心臟基因的表達，作為心臟發(fā)育的核心調控因子的GATA-4，其本身蛋白水平的變化可引發(fā)其它相關因子的瀑布式效應[12]，繼而導致胚胎期心臟發(fā)育異常，最終誘發(fā)心臟組織結構異常如突變型GATA-4致二尖瓣與三尖瓣肥厚[15]； GATA-4具有直接調控抗凋亡蛋白Bcl-XL和激活Bcl-2啟動子的作用，進而阻止心肌細胞的程序性死亡[16]；GATA-4作為一個抗凋亡因子，對心臟發(fā)育過程起著保護作用[17]。本實驗中GATA-4蛋白表達降低可能與其抗凋亡作用減弱有關，進而導致心臟發(fā)育異常。與此同時研究表明：培養(yǎng)的心肌細胞中過表達GATA-4可上調Bcl-2的表達；作為GATA-4下游的抗凋亡蛋白，Bcl-2能夠抑制細胞的自噬作用，且減少的GATA-4和細胞自噬作用的誘發(fā)是緊密相關的;GATA-4是作為一個能對許多心臟基因進行調節(jié)的正面轉錄調控體，既有抗凋亡作用也有抗細胞自噬作用的活性[18]。此外研究發(fā)現：培養(yǎng)的心肌細胞中高濃度糖可誘導ROS的產生及細胞死亡，給予糖尿病模型鼠抗氧化劑治療對于延緩心臟發(fā)育的病理過程具有一定的作用，但其作用于人類糖尿病相關的心臟發(fā)育過程中具有很多的限制性效應，尚需前瞻性臨床資料證實之?？傊柚笹ATA-4蛋白表達的減少和/或提升GATA4-Bcl-2的表達之治療策略有減少GDM所致的胎兒心臟發(fā)育異常之可能性。

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ExpressionoftranscriptionfactorGATA-4duringcardiacdevelopmentinfetalmicefromgestationaldiabetesmellitusmice

SUN Feng-jie1, REN Jian-bing1, HUANG Xiao1, WU Xia1, LI Yan2, YANG Xue-song2, LIU Guo-sheng1

(1DepartmentofNeonatology,theFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofHistologyandEmbryology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tlgs@jnu.edu.cn)

AIM: To study the expression of transcription factor GATA binding protein 4 (GATA-4) in the development of the cardiac tissues in the fetal mice from gestational diabetes mellitus (GDM) mice, and to investigate the potential pathogenesis of GDM-induced congenital cardiac defects in mice.METHODSThe adult Sprague-Dawley female mice were randomly divided into control group (n=40) and GDM group (n=40). The GDM model was established by intraperitoneal injection of 2% streptozotocin (STZ, 40 mg/kg body weight in 0.1 mol/L sodium citrate, pH 4.4) to the pregnant mice on the successive days. The mice in control group were injected with citric acid-sodium citrate buffer solution in the same position. Blood glucose and body weight were examined every day after STZ injection for 72 h. On E12, E15 and E19, the mice were anaesthetized and the embryonic cardiac tissues were collected after caesarean section. The histopathological changes of the cardiac tissues were observed under microscope with HE staining. The expression of GATA-4 was analyzed by the method of immunohistochemistry. The expression of GATA-4 in cardiac tissues at mRNA and protein levels was determined by real-time fluorescence quantitative RT-PCR and Western blotting.RESULTSDuring the development of embryonic heart, the expression of GATA-4 protein in the cardiac tissue was observed on E12, and it was obviously increased on E15, but it was decreasd on E19. Compared with control group, the expression of GATA-4 protein in GDM group was decreased at the time points of E12, E15 and E19. The mRNA expression of GATA-4 in GDM group was lower than that in control group at the same time points. Compared with control group, the protein level of GATA-4 in GDM group was diminished.CONCLUSIONThe morbidity of fetal cardiac malformation is significantly increased in GDM group, suggesting that GATA-4 may be involve in the development of cardiac malformation in GDM.

GATA binding protein 4; Gestational diabetes mellitus; Cardiac development

R363

A

1000-4718(2013)03-0449-06

2012- 11- 04

2012- 12- 28

暨南大學第一臨床醫(yī)學院科研培育專項基金

△通訊作者 Tel:020-38688838; E-mail: tlgs@jnu.edu.cn

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.03.012