王曉霞， 李曉鐘， 路 娜， 趙 艷， 王 康， 裴 毅

(1山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 山西 太原 030001; 2山西省人民醫(yī)院急診科,山西 太原 030012; 3山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山西大醫(yī)院老年腫瘤科, 山西 太原 030032)

STK15過表達(dá)對(duì)人食管癌細(xì)胞株KYSE150生長的影響*

王曉霞1△， 李曉鐘2， 路 娜1， 趙 艷1， 王 康1， 裴 毅3

(1山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 山西 太原 030001;2山西省人民醫(yī)院急診科,山西 太原 030012;3山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山西大醫(yī)院老年腫瘤科, 山西 太原 030032)

目的探討絲氨酸/蘇氨酸激酶15 (serine/threonine kinase 15，STK15)過表達(dá)對(duì)人食管癌細(xì)胞株KYSE150生長的影響。方法采用脂質(zhì)體法將pEGFP-C1-STK15真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人食管鱗癌細(xì)胞株KYSE150，構(gòu)建STK15過表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系(GFP-STK15)，通過熒光顯微鏡和Western blotting檢測STK15的表達(dá)。采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法觀察STK15過表達(dá)對(duì)體外腫瘤細(xì)胞生長的影響。通過流式細(xì)胞術(shù)分析STK15過表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響。采用裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)觀察STK15過表達(dá)對(duì)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長的影響。結(jié)果pEGFP-C1-STK15質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后篩選得到穩(wěn)定克隆，熒光顯微鏡顯示GFP-STK15融合蛋白定位于細(xì)胞的中心體以及紡錘體，Western blotting可檢測到GFP-STK15 融合蛋白的表達(dá)。與對(duì)照細(xì)胞相比，GFP-STK15細(xì)胞系的體外生長能力明顯增加；G0/G1期細(xì)胞百分率降低，細(xì)胞凋亡率減少；GFP-STK15細(xì)胞系接種組裸鼠腫瘤明顯增大，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論STK15過表達(dá)能促進(jìn)人食管癌KYSE150細(xì)胞的生長，提示STK15將可能成為治療食管癌的新靶點(diǎn)。

絲氨酸/蘇氨酸激酶15； 食管腫瘤； 細(xì)胞增殖

絲氨酸/蘇氨酸激酶15 (serine/threonine kinase 15)，又名BTAK (breast tumor-amplified kinase)、Aurora-A、Aurora-2或AIK (Aurora/Ipl1 kinase)[1]。STK15在高等真核生物細(xì)胞分裂的過程中具有重要的作用，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G2/M轉(zhuǎn)變、中心體的分離與成熟、紡錘體的裝配以及胞質(zhì)分裂等[2]。研究發(fā)現(xiàn)，STK15在許多腫瘤包括食管癌中存在過表達(dá)[3-11]。為了進(jìn)一步探討STK15在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們將pEGFP-C1-STK15真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人食管鱗癌細(xì)胞，建立STK15過表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系，以研究其對(duì)體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞生長的影響，從而為腫瘤的治療尋求新的特異靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1材料

人食管鱗癌KYSE150細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫；pEGFP-C1 載體由本室保存；DH5α菌株由本室保存。限制性內(nèi)切酶、DNA marker、T4 DNA 連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶及引物購自TaKaRa；質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen；RPMI-1640培養(yǎng)基、小牛血清購自HyClone；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 購自Invitrogen；STK15抗體購自Cell Signal；β-actin抗體購自Santa Cruz；裸鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

2方法

2.1STK15 基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 用Trizol試劑抽提正常食管組織總RNA，以其為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, 再以cDNA為模板擴(kuò)增STK15基因。上游引物序列加入XhoⅠ酶切位點(diǎn): 5’-GCCTCGAGGCATGGACCGATC-3’; 下游引物序列加入BamHⅠ酶切位點(diǎn): 5’-CGGGATCCCTAAGACTGTTTG-3’。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min 后94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，末次循環(huán)后72 ℃ 10 min。STK15基因的cDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物及pEGFP-C1載體均用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠純化。基因片段及載體由T4 DNA 連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌，挑取單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定。同時(shí)經(jīng)XhoⅠ單酶切以及XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后，用1%瓊脂糖電泳鑒定。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 KYSE150細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)70%融合時(shí)，按LipofectamineTM2000說明書將pEGFP-C1-STK15重組質(zhì)粒及空載體pEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)。48 h后加入G418篩選，14 d后獲得STK15穩(wěn)定表達(dá)克隆及對(duì)照克隆，并擴(kuò)大培養(yǎng)，采用熒光顯微鏡和Western blotting鑒定。

2.3Western blotting檢測 腫瘤細(xì)胞或裸鼠腫瘤組織用PBS漂洗2遍, 加入細(xì)胞裂解液，置于冰上40 min，12 000 r/min離心20 min后, 收集上清即為細(xì)胞提取蛋白。經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，以STK15(1∶1 000稀釋)為Ⅰ抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為Ⅱ抗，經(jīng)孵育洗膜后ECL曝光顯影，檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參照。圖像分析系統(tǒng)測定灰度值。

2.4MTT法測定細(xì)胞生長曲線 將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種3 000個(gè)細(xì)胞，設(shè)8個(gè)平行孔。分別在1、3、5、7和9 d以MTT法檢測其吸光度(A)。檢測前棄去上清，每孔加入100 μL含0.2 g/L MTT的無血清培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)4 h后棄去上清，并加入150 μL DMSO，混勻后，在酶標(biāo)儀上用波長為570 nm測定A值，并繪制生長曲線。

2.5流式細(xì)胞術(shù)分析 胰酶消化并收集細(xì)胞，預(yù)冷的70%乙醇4 ℃固定過夜。加入RNase A(1 g/L)，37 ℃水浴30 min，再加入PI染色液(50 mg/L)，至4 ℃避光30 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡率。以G2/M期和S期細(xì)胞百分比之和代表細(xì)胞的增殖能力。

2.6裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn) 裸鼠12只，隨機(jī)分為2組，每組各6只。分別取1×106個(gè)細(xì)胞懸浮于0. 2 mL PBS 中，在無菌條件下接種裸鼠(BALB/cnu/nu)左側(cè)前肢皮下，3個(gè)月后處死動(dòng)物剝?nèi)×鲶w，測量腫瘤體積并拍照。

2.7逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 參照Trizol 說明書提取裸鼠腫瘤組織總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增STK15基因，上游引物5′-AATGATTGAAGGTCGGATGC-3′，下游引物5′-TTCTCTGAGCATTGGCCTCT-3′。以看家基因GAPDH 為內(nèi)參照，上游引物5′-GCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3′，下游引物5′-GCCAGGGGTGCTAAGCAGTT-3′。引物由TaKaRa合成。反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30 個(gè)循環(huán)。圖像分析系統(tǒng)測定灰度值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.5 軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1pEGFP-C1-STK15表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

真核表達(dá)載體pEGFP-C1 分子量大小為4.7 kb，在綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)讀碼框的C 端含有多克隆位點(diǎn)，可供外源基因插入，從而構(gòu)建得到EGFP-C1-STK15重組質(zhì)粒。pEGFP-C1和EGFP-C1-STK15載體單酶切后經(jīng)瓊脂糖電泳，可見分子量約為4.7 kb和5.9 kb的片段。重組體雙酶切后經(jīng)瓊脂糖電泳，可得到1條約為1.2 kb的目的片段和1條約為4.7 kb 的載體片段，見圖1，與預(yù)期結(jié)果相符，表明STK15基因已插入到pEGFP-C1載體中。測序進(jìn)一步證實(shí)重組質(zhì)粒中插入的目的基因片段大小、方向和插入位點(diǎn)均正確。

Figure 1. Identification of recombinant pEGFP-C1-STK15 expression vector by enzyme digestion. 1: pEGFP-C1-STK15 digested byXhoⅠ+BamHⅠ; 2: pEGFP-C1-STK15 digested byXhoⅠ；3: pEGFP-C1 digested byXhoⅠ.

圖1重組質(zhì)粒pEGFP-C1-STK15的酶切鑒定

2熒光鏡下觀察GFP-STK15的表達(dá)

pEGFP-C1-STK15載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，熒光鏡下可觀察到綠色熒光，見圖2，GFP標(biāo)記的STK15蛋白主要定位于細(xì)胞的中心體以及紡錘體(GFP-STK15)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[2]，證明STK15載體構(gòu)建成功并能在細(xì)胞中正確表達(dá)。pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后也可觀察到綠色熒光，GFP在胞質(zhì)及胞核均有表達(dá)(control)。

3Westernblotting檢測STK15蛋白的表達(dá)

pEGFP-C1-STK15質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后篩選出4個(gè)穩(wěn)定克隆(將其命名為GFP-STK15)，可以檢測到分子量為73 kD的GFP-STK15融合蛋白。而空載體轉(zhuǎn)染后篩選到的5個(gè)細(xì)胞克隆并未檢測到此條帶(將其命名為control)，僅有1條內(nèi)源性的STK15蛋白表達(dá)條帶，見圖3。而且，灰度分析顯示GFP-STK15細(xì)胞系中總STK15表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，證明STK15過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功。選取外源性STK15蛋白表達(dá)相對(duì)比較高的一株細(xì)胞克隆以及隨機(jī)選取一株空載細(xì)胞克隆進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 2. The location of GFP-STK15 protein in ESCC KYSE150 cell line detected by fluorescence microscopy.A:GFP-STK15;B:control.

圖2熒光鏡下觀察GFP-STK15在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

Figure 3. The expression of STK15 protein and GFP-STK15 fusion protein in ESCC KYSE150 cell line detected by Western blotting.

圖3Westernblotting鑒定STK15蛋白和GFP-STK15融合蛋白在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)

4STK15過表達(dá)對(duì)體外腫瘤細(xì)胞生長的影響

如圖4所示，GFP-STK15細(xì)胞系的生長能力明顯高于對(duì)照細(xì)胞，差異顯著(P<0.01)。

5STK15過表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響

如表1所示，與對(duì)照組相比，GFP-STK15細(xì)胞系G0/G1期細(xì)胞百分率明顯降低，細(xì)胞增殖率明顯增加，細(xì)胞凋亡率有所減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

6STK15過表達(dá)對(duì)裸鼠腫瘤生長的影響

裸鼠接種腫瘤細(xì)胞1周后，可觀察到皮下腫瘤出現(xiàn)。3個(gè)月后處死裸鼠，隨機(jī)選取每組各1只裸鼠拍照，GFP-STK15細(xì)胞系接種組腫瘤明顯大于對(duì)照組，差異顯著(P<0.01)，見圖5。

Figure 4. Effects of STK15 overexpression on growth of ESCC KYSE150 cell line detected by MTT assay. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol.

圖4STK15過表達(dá)對(duì)體外腫瘤細(xì)胞生長的影響

表1STK15過表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響

Table 1. Effects of STK15 overexpression on cell cycle distribution and apoptosis of ESCC KYSE150 cell line detected by flow cytometry (%. Mean±SD.n=3)

GroupG0/G1ProliferationrateApoptoticrateControl44.1±1.555.9±1.62.8±0.3GFP-STK1529.4±1.2**70.6±1.9**1.6±0.2**

**P<0.01vscontrol.

7RT-PCR和Westernblotting檢測STK15在裸鼠腫瘤組織中的表達(dá)

隨機(jī)選取3個(gè)GFP-STK15細(xì)胞系接種組和3個(gè)對(duì)照組裸鼠腫瘤組織，進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示，GFP-STK15細(xì)胞系接種組裸鼠腫瘤組織中STK15 mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，灰度分析顯示2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖6A。Western blotting檢測結(jié)果顯示在GFP-STK15細(xì)胞系接種組裸鼠腫瘤組織中可檢測到GFP-STK15融合蛋白的表達(dá)，而對(duì)照組僅可檢測到內(nèi)源性STK15蛋白的表達(dá)，灰度分析顯示2組STK15總蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖6B。

討 論

食管癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)涉及多基因、多分子水平變化的非常復(fù)雜的過程。研究表明，腫瘤抑癌基因p53、Rb和ras在食管癌中存在點(diǎn)突變；myc、cyclin D1等癌基因在食管癌中均有不同程度的擴(kuò)增[9, 12]。近年來，一種參與有絲分裂的絲氨酸/蘇氨酸激酶——STK15備受關(guān)注，這是因?yàn)樗c許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如在乳腺癌[3]、肝癌[4]、卵巢癌[5]、鼻咽癌[6]、前列腺癌[7]、腎癌[8]等癌癥中均發(fā)現(xiàn)有STK15的過表達(dá)。另外在食管癌中也存在STK15的過表達(dá)，而且STK15的表達(dá)水平與食管癌的侵襲潛能和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[9-11]。因此，深入研究STK15在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用，將有助于進(jìn)一步闡明食管癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。

Figure 5. Effects of STK15 overexpression on tumor growth of nude mice. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol.

圖5STK15過表達(dá)對(duì)裸鼠腫瘤生長的影響

本研究采用基因工程技術(shù)構(gòu)建STK15基因的重組表達(dá)載體pEGFP-C1-STK15，通過雙酶切和測序鑒定均證實(shí)載體構(gòu)建成功。而且，pEGFP-C1質(zhì)粒含有GFP作為報(bào)告基因，在熒光顯微鏡下可顯示綠色熒光，該基因與目的基因STK15連接形成融合基因，不影響目的基因的表達(dá)[13]，可以追蹤目的基因STK15在細(xì)胞中的定位以及表達(dá)情況。因此，重組表達(dá)載體pEGFP-C1-STK15的成功構(gòu)建為后續(xù)研究奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究進(jìn)一步采用脂質(zhì)體法將重組表達(dá)載體pEGFP-C1-STK15穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人食管鱗癌細(xì)胞，證實(shí)GFP-STK15主要定位于細(xì)胞的中心體以及紡錘體，說明pEGFP-C1-STK15載體能在細(xì)胞中正確表達(dá)。同時(shí)Western blotting進(jìn)一步證實(shí)篩選得到了STK15過表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞克隆。而且，我們發(fā)現(xiàn)STK15過表達(dá)能促進(jìn)體外腫瘤細(xì)胞和體內(nèi)裸鼠腫瘤細(xì)胞的生長，并使G0/G1期細(xì)胞百分率降低，細(xì)胞增殖率增加，細(xì)胞凋亡率減少，提示STK15過表達(dá)可能通過加速細(xì)胞周期進(jìn)程和抑制細(xì)胞凋亡而促進(jìn)腫瘤生長。與對(duì)照組相比，STK15過表達(dá)細(xì)胞系接種組裸鼠腫瘤組織中存在STK15過表達(dá)，進(jìn)一步說明STK15過表達(dá)促進(jìn)了裸鼠腫瘤的生長。Tanaka等[14]曾經(jīng)報(bào)道，利用RNA干擾抑制STK15的表達(dá)，可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長，與本文研究結(jié)果相一致。綜上所述，本研究初步揭示了STK15過表達(dá)對(duì)食管癌發(fā)生發(fā)展的影響，因而為進(jìn)一步闡明STK15的功能提供了一定的實(shí)驗(yàn)和研究基礎(chǔ)，提示STK15將可能成為治療食管癌的新靶點(diǎn)。

Figure 6. The expression of STK15 mRNA (A) and protein (B) in tumor tissues of nude mice detected by RT-PCR (A) and Western blotting (B), respectively. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol.

圖6RT-PCR和Westernblotting檢測STK15在裸鼠腫瘤組織中的表達(dá)

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EffectsofSTK15overexpressionongrowthofhumanesophagealcarcinomacelllineKYSE150

WANG Xiao-xia1, LI Xiao-zhong2, LU Na1, ZHAO Yan1, WANG Kang1, PEI Yi3

(1DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2DepartmentofEmergency,ShanxiProvincialPeople’sHospital,Taiyuan030012,China;3DepartmentofGeriatricOncology,ShanxiAcademyofMedicalSciences,ShanxiDayiHospital,Taiyuan030032,China.E-mail:wxiaoxia99007@126.com)

AIM: To investigate the effects of serine/threonine kinase 15 (STK15) overexpression on the growth of human esophageal squamous-cell carcinoma (ESCC) cell line KYSE150.METHODSRecombinant pEGFP-C1-STK15 expression vector was transfected into KYSE150 cells using LipofectamineTM2000 and the expression of STK15 was detected by fluorescence microscopy and Western blotting. The proliferation of the cellsinvitrowas measured by MTT assay. The cell cycle distribution and apoptosis were detected by flow cytometry. The proliferation of the cellsinvivowas measured by tumorigenicity experiment in nude mice.RESULTSAfter recombinant pEGFP-C1-STK15 expression vector was stably transfected into KYSE150 cells, GFP-STK15 fusion protein localized to centrosome and spindle. The STK15-overexpressing colonies were further confirmed by Western blotting. MTT assay showed that the proliferation of the cells in STK15 overexpression group was increased compared with control group (P<0.01). Flow cytometry analysis showed that the percentage of the cells in G0/G1phase and the cell apoptosis in STK15 overexpression group were decreased compared with control group (P<0.01). The tumorigenicity experiment in nude mice showed that the proliferation of the cells in STK15 overexpression group was increased compared with control group (P<0.01).CONCLUSIONOverexpression of STK15 in human ESCC KYSE150 cells promotes the cell growthinvitroandinvivo, indicating that STK15 may serve as a novel therapeutic target for esophageal carcinoma.

Serine/threonine kinase 15; Esophageal neoplasms; Cell proliferation

R735.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.007

1000- 4718(2013)11- 1957- 05

2013- 05- 10

2013- 07- 17

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 30973401)；山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2009011052)

△通訊作者 Tel: 0351-4135637； E-mail: wxiaoxia99007@126.com