林建原，陸 興

浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，寧波 315100

稀土是化學(xué)元素周期表中的鑭系元素以及與鑭系的15個元素密切相關(guān)的兩個元素—鈧和釔共17種元素［1］。稀土元素具有特殊的理化性質(zhì)，在石油化工、玻璃陶瓷、環(huán)境保護、醫(yī)藥等方面有廣泛的應(yīng)用［2］。近年來，隨著人們對稀土元素的深入研究，發(fā)現(xiàn)稀土元素具有特殊的生物學(xué)效應(yīng)［3］。蘆丁是一種黃酮類化合物，在植物體中的根、莖、葉、種子、果實中廣泛存在［4］，例如蕓香科的蕓香草，豆科的槐米，蓼科的蕎麥等都含有蘆?。?］，可用于防治腦溢血、視網(wǎng)膜出血、高血壓、急性出血性腎炎，治療風(fēng)濕性頭痛等。目前，國內(nèi)外學(xué)者對于蘆丁的抗氧化性和清除自由基活性已有深入研究，但對蘆丁及其稀土配合物的相關(guān)研究鮮見報道。本文合成了蘆丁稀土釤配合物，測定了蘆丁及其配合物清除自由基的能力，同時通過對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌實驗，研究蘆丁及其稀土配合物的抑菌性能。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 實驗儀器

F-4500型熒光分光光度計(日本日立公司);HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司);DZF-6020真空干燥箱(上海慧泰儀器制造有限公司);SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(上海青浦滬西儀器制造有限公司);UV-3200PCS紫外分光光度計(上海美普達儀器有限公司);AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);DL-1電爐(上海錦凱科學(xué)儀器有限公司);TC-15套式恒溫器(新華醫(yī)療器械廠);SW-CJ-ICU無菌操作臺潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);Vertex 70傅立葉紅外光譜儀(德國Bruker公司);游標(biāo)卡尺。

1.1.2 試劑及配制

蘆丁(BR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司);氧化鑭(99.99%，阿拉丁);無水乙醇(AR);濃鹽酸(AR);雙氧水(AR);小牛浸膏(杭州微生物實際有限公司);蛋白胨(BR，上海展云化工有限公司);NaCl(99.5%);瓊脂(BR，上海展云化工有限公司);無水 Na2CO3(AR);KBr(AR);苯甲酸鈉(AR，);鄰苯三酚(AR);硫酸亞鐵銨(AR);Tris(三羥甲基氨基甲烷，BR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司);EGTA(乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸，AR);DPPH·(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，96%，阿拉丁)，合成的釤蘆丁配合物和蘆丁分別用二甲基亞砜溶解，EGTA用氫氧化鈉溶解，DPPH·用無水乙醇溶解。

1.2 試驗部分

1.2.1 蘆丁-釤配合物的合成

稱取適量氧化釤于一小燒杯中，加雙氧水3～5 mL，逐滴滴加1∶1鹽酸至固體氧化釤全部溶解，在水浴鍋中加熱至基本無氣泡，將溶液在電爐上蒸干，除去過量的雙氧水、鹽酸以及多余的水分得到稀土氯化物粉末，蒸去。

稱取1 mmol蘆丁，加100 mL無水乙醇，微熱攪拌使蘆丁溶解，向蘆丁乙醇溶液中加入適量的2.0 mmol無水碳酸鈉，2.2 mmol稀土氯化物粉末，在100～110℃回流4 h，抽濾，經(jīng)無水乙醇洗滌固體2～3次，放入真空干燥中60℃下干燥至恒重得到棕黃色固體。

1.2.2 羥基自由基(·OH)清除活性［6］

在燒杯中依次加入0.4 mL 3.8 mmol/L的EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)、0.2 mL 0.01 mol/L的苯甲酸鈉溶液、3.2 mL的蒸餾水、2 mL 3.8 mmol/L的硫酸亞鐵銨溶液、0.2 mL的雙氧水，快速搖勻并且倒入石英比色皿中，以300 nm為激發(fā)波長，415 nm為發(fā)射波長，立即測定在此波長處的熒光強度，繪制動力學(xué)曲線，該曲線于0～6 min部分的斜率為k0。

蘆丁和蘆丁-釤配合物的熒光動力學(xué)曲線測定:分別配制6種不同濃度的蘆丁和蘆丁-釤配合物濃度，按照上述試劑加入順序，蒸餾水加入量依次變?yōu)?.0、2.8、2.6、2.4、2.2、2.0 mL，且在加入雙氧水之前分別加入樣品 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，用2.2.2同方法測定該曲線0～6 min的斜率為k。以下列公式計算蘆丁和蘆丁-釤配合物對羥基自由基的抑制率:

研究氧自由基的清除有直接法和間接法［9］。在燒杯中依次加入4 mL的Tris.HCl緩沖液、1.4 mL的蒸餾水、0.6 mL的鄰苯三酚，快速搖勻并且倒入石英比色皿中，以448 nm為激發(fā)波長，500 nm為發(fā)射波長，立即測定在此波長的熒光強度，繪制動力學(xué)曲線，該曲線0～6 min部分的斜率為k0。

測定蘆丁和蘆丁-釤配合物的熒光動力學(xué)曲線:分別配制6種不同濃度的蘆丁和蘆丁-釤配合物，用上述同方法測定，該曲線0～6 min部分的斜率為k。按下列公式計算蘆丁和蘆丁-釤配合物對氧自由基的抑制率:

1.2.4 DPPH·自由基清除活性［6］

取2.0 mL 0.3 mmol/L的DPPH·自由基，加蒸餾水定容至10 mL。放置30 min，以蒸餾水為空白，測定517 nm波長處的吸光度，此為A0，另取12個比色管，加入2.0 mL的DPPH·自由基和不同量的樣品液，用蒸餾水定容至10 mL，按上述相同方法測定其吸光度，此為A，按下列公式計算蘆丁和蘆丁-釤配合物對DPPH·自由基的抑制率:

1.2.5 抑菌能力

1.2.5.1 制備培養(yǎng)基［7］

稱取蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，牛肉膏3 g，瓊脂15～20 g于燒杯中，加入蒸餾水1000 mL用電爐加熱溶解至顏色呈透明，在加熱過程中不斷用玻璃棒攪拌，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，倒入錐形瓶中在121℃高壓滅菌鍋中滅菌30 min備用。

1.2.5.2 接種

將培養(yǎng)基加入1000 mL錐形瓶中，在121℃滅菌后倒平板放到37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，去除染菌的培養(yǎng)基，然后在無菌室內(nèi)接入大腸桿菌、金黃色葡萄球菌。接種完畢后在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.5.3 抑菌試驗

(1)樣品的制備:將蘆丁用乙醇溶解，配制濃度為2.6 mg/mL的溶液，蘆丁-釤配制成2.5 mg/mL濃度的溶液。

(2)紙片的制備:剪取直徑約6 mm的紙片在121℃的滅菌鍋中滅菌后，于無菌室中將紙片分別浸泡于蒸餾水、DMSO溶液，蘆丁、蘆丁-稀土釤中，取出置干燥箱中干燥后保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 配合物的光譜表征

2.1.1 紅外光譜分析

用KBr壓片法測得蘆丁-釤配合物和蘆丁的紅外特征吸收光譜，見圖1。

圖1 蘆丁-釤配合物(1)與蘆丁(2)的紅外光譜Fig.1 The IR-VIS spectra of Rutin-Sm complex(1)and rutin(2)

由表1的主要吸收頻率可知，蘆丁和蘆丁-釤在3378 cm-1處出現(xiàn)的寬峰主要為水及醇、酚羥基的伸縮振動吸收峰。由于蘆丁帶有多個羥基，生成配合物時對此峰基本無影響［8］。蘆丁在1655.36 cm-1處出現(xiàn)的羰基伸縮振動吸收峰，在蘆丁-釤配合物中，該峰向低波數(shù)區(qū)位移到1624.51 cm-1處，向低波數(shù)位移了30 cm-1，這說明羰基參與了配位反應(yīng)［9］，配位作用使C=O鍵減弱，相應(yīng)吸收峰向低波數(shù)位移。蘆丁-釤中苯環(huán)兀鍵共軛體系的C=C鍵伸縮振動吸收峰，向低波數(shù)方向位移40 cm-1，是配位反應(yīng)對苯環(huán)共軛體系的影響所致。蘆丁在1362.31、1296.21 cm-1處的兩個譜峰是酚羥基的C-O鍵伸縮振動與O-H鍵面內(nèi)變形振動偶合所致。配合物中這兩個峰均出現(xiàn)在1355.22、1273.00 cm-1處，均向低波數(shù)方向位移分別為7.23 cm-1，說明酚羥基參與了配位成鍵。配體在1203.99 cm-1到1168.78 cm-1處的吸收峰是醚的C-O-C伸縮振動吸收峰，配合物中此峰基本保留在原來的位置，排除了醚氧原子成鍵的可能。

表1 蘆丁和蘆丁-釤的主要紅外吸收頻率Table 1 Principal characteristic IR absorption frequency of rutin and Rutin-Sm complex

2.1.2 紫外吸收光譜分析

圖2 蘆丁和蘆丁-釤配合物的紫外吸收光譜Fig.2 UV-VIS spectra of rutin and Rutin-Sm complex

由紫外吸收光譜分析的吸收數(shù)據(jù)可知，在蘆丁-釤中存在桂皮酰基和苯甲?；虼擞袃蓚€主要的紫外吸收峰Ⅰ和Ⅱ，圖2所示。實驗表明，形成稀土釤-蘆丁配合物后，帶Ⅰ、帶Ⅱ的吸收峰發(fā)生了紅移，兩者比較發(fā)現(xiàn)，蘆丁-釤配合物和蘆丁的紫外吸收峰的位置和強度均有改變，表明稀土離子和配體之間確有鍵合作用。

2.2 清除自由基活性

2.2.1 清除·OH自由基活性

按1.2.2方法，采用Fenton反應(yīng)生成羥基自由基，再與苯甲酸反應(yīng)，生成的羥基苯甲酸具有較強的熒光效率，可以通過測定羥基苯甲酸的生成速率間接測定羥基自由基的生成速率，其中Fenton反應(yīng)式為:Fe2++H2O2=Fe3++ ·OH+OH-。

如圖3所示，隨著加入蘆丁和蘆丁-釤濃度的增加，抑制率也隨之增加。蘆丁-釤配合物和蘆丁均具有清除·OH的能力，且配合物的清除能力強于蘆丁。

圖3 蘆丁及蘆丁釤配合物對羥基自由基(·OH)的抑制率Fig.3 Scavenging activities of rutin and Rutin-Sm complex on Hydroxyl radicalp

利用分光光度法測定鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物隨時間的變化曲線。按1.2.3實驗方法分別測定蘆丁-釤配合物及蘆丁清除的能力。圖4所示，蘆丁-稀土釤配合物及蘆丁清除氧自由基的能力隨著含量的增大而增大，且配合物清除能力明顯強于蘆丁。

圖4 蘆丁及蘆丁釤配合物對超氧自由基)的抑制率Fig.4 Scavenging activities of rutin and Rutin-Sm complex on superoxide anion radical

2.2.3 清除DPPH·活性

DPPH·是一種較穩(wěn)定的自由基，在乙醇溶液中顯紫色，在吸收波長517nm處吸收強度最大。當(dāng)自由基清除劑存在時，DPPH·的單電子配對，DPPH·濃度減小而使其顏色變淺，吸光度也減小。按1.2.4實驗方法分別測定了蘆丁-釤配合物和蘆丁對DP PH·自由基的抑制作用，如圖5所示。且配合物清除DPPH·自由基的能力高于蘆丁。

圖5 蘆丁及蘆丁釤配合物對DPPH·自由基的消除率Fig.5 Scavenging activities of rutin and Rutin-Sm complex on DPPH·radical

2.3 抑菌能力分析

2.3.1 抑菌圈的測定:在無菌室中，將培養(yǎng)好的大腸桿菌菌種涂布于培養(yǎng)基表面，然后分別將用蒸餾水、DMSO、蘆丁和蘆丁-釤浸泡過的濾紙片放入不同的培養(yǎng)基中。在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后觀察。金黃色葡萄球菌的操作如同。用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的大小。

表2 抑菌圈大小(d=mm)Table 2 Inhibition zone(d=mm)

由表2可知，蘆丁及蘆丁-稀土釤配合物能抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，由抑菌圈直徑可知配合物蘆丁-釤的抑菌活性強于蘆丁。

2.3.2 最低抑菌濃度的測定:將濃度為2.6 mg/mL的蘆丁溶液依次稀釋，將溶液用無菌吸量管取一定量加入培養(yǎng)基中涂勻培養(yǎng)基，用接種環(huán)將配置好的2種菌液分別接種于對應(yīng)的培養(yǎng)基中放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)。蘆丁-釤的操作同上。用肉眼觀察完全沒有菌落生長的最低溶液濃度作為最低抑菌濃度(MIC)。

表3 最低抑菌濃度的抑菌能力Table 3 Antibacterial activity of minimum inhibition concentration

“-”代表“不長菌”;“+”代表“長菌”。“-”means“no bacterium grow”;“+ ”means“have bacterium grow”.

由表3可知，蘆丁-釤配合物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度可達2.6×10-3mg/mL。在低濃度下所得稀土蘆丁配合物仍然具有明顯的抑菌活性，表明蘆丁-釤的抑菌活性強于蘆丁。

2.3.3 最低殺菌濃度的測定:從抑菌實驗“不長菌”培養(yǎng)基中，取出一定量培養(yǎng)物接種到不含其它樣品的培養(yǎng)基中，涂勻培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。觀察有無菌落生長，少于5個菌落的為最低殺菌濃度(MBC)。

表4 最低殺菌濃度測定Table 4 Determination of Minimum bactericidal concentration

根據(jù)抑菌圈大小可以初步確定物質(zhì)的抑菌能力大小，抑菌圈直徑越大表明抑菌活性越高，表4可知蘆丁和蘆丁-釤配合物濃度較高時，具有強抑菌作用。且稀土蘆丁-釤配合物的抑菌效果明顯大于蘆丁，且對金黃色葡萄球菌抑菌活性強于大腸桿菌的抑菌活性。原因可能是由于蘆丁和配合物與肽鏈和細(xì)胞磷脂上的羧基具有較強的親和力，可以與菌的轉(zhuǎn)移核糖核酸中的磷?；I合，抑制其核酸酶的活性以及功能，使細(xì)菌的生長受到抑制而達到抑菌效果;另由于蘆丁和釤形成配合物后，配合物的分子量變大，脂溶性隨之增強，同時對細(xì)胞膜的穿透力增強，使生物體生長以及代謝需要的關(guān)鍵成分都流失，破壞生物體正常運轉(zhuǎn)活動［8］，蘆丁和蘆丁-釤配合物的抑菌效果就是由于此原因而體現(xiàn)出來。

3 結(jié)論

實驗選用菌種革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)、革蘭氏陰性菌(金黃色葡萄球菌)進行抑菌實驗，實驗發(fā)現(xiàn)，稀土釤蘆丁配合物的抑菌效果隨配合物濃度的增加，抑菌活性顯著增大，最低抑菌濃度可達2.6×10-3mg/mL。通過熒光動力學(xué)曲線發(fā)現(xiàn)蘆丁和蘆丁-釤配合物對DPPH·自由基、·OH自由基及O-·2自由基均有一定的清除能力。

1 Zheng HL(鄭海雷)，Zhao ZQ(趙中秋)，Zhang CG(張春光)，et al.Advances in mechanism research of rare earth biological effect.Rare Earth(稀土)，2000，21(4):55.

2 Zhou XA(周先安)，Xu YH(徐瑩豪)，Chen XK(陳小軻)，et al.Study on synthesis，characterization and biological activity of rare earth samarium binary and ternary complexes.Applied Chem Ind(應(yīng)用化工)，2011，40:199.

3 Lin JY(林建原)，Luo LF(駱林峰)，Chen L(陳亮)，et al.Synthesis，characterization and antibacterial activity of rare earth lanthanum-rutin complex.J Textile Res(紡織學(xué)報)，2012，33(5):81-90.

4 Long QJ(龍全江)，Yang T(楊韜).The research situation and prospect of rutin.Chin J Inf TCM(中國中醫(yī)藥信息雜志)，2002，9(4):39-41.

5 Lin JY(林建原)，Tao ZH(陶志華)，Zhu SS(朱釤汕).Extraction and antioxidant activity evaluation of total flavonoids from bayberry leaves.Food Sci(食品科學(xué))，2011，32(20):26-29.

6 Wang JJ(王俊杰)，Yao SK(姚勝昆)，He CX(赫春香).Study on synthesis of complex germanium(IV)-Rutin and its scavenging activity of oxygen free radical.J Spectro Lab(光譜實驗室)，2010，27:502-504.

7 Ni JZ(倪嘉纘).Rare Earth Bioinorganic Chemistry.Beijing:Beijing Science Press，1995.42-45.

8 Yang ML(楊美玲)，Yang PJ(楊培菊)，Song YM(宋玉民).Synthesis，characterization and interaction of transition metal complex of rutin with BSA and HSA.Chin J Inorg Chem(無機化學(xué)學(xué)報)，2005，21:483-489.

9 Zhao YX(趙瑤興)，Sun XY(孫翔玉).Spectral Identification of Organic Molecular Structure.Beijing:Beijing Science Press，2003.72-74.