張國軍 譚延國 張然星 張 巖 亢 濤 車冬麗 鄭芳芳 王曉寧 李 佩

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院檢驗科，北京100050;2.首都醫(yī)科大學附屬復興醫(yī)院檢驗科，北京100038;3.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院檢驗科，北京100102)

由于胰島素(insulin，INS)在糖尿病等相關疾病的發(fā)生、發(fā)展、預后和診治中的獨特地位，對其血清水平的測定早已成為臨床實驗室的常規(guī)檢測項目，并得到日益的重視。隨著生物科技的發(fā)展，其檢測方法也逐步由放射免疫學的檢測方法，逐漸向酶聯(lián)免疫吸附試驗、化學發(fā)光免疫分析法發(fā)展。現(xiàn)階段化學發(fā)光法已成為檢測血清胰島素水平的主流方法，并且由于自動化檢測系統(tǒng)的普及，極大地提升了實驗的精密度。但迄今為止，由于仍無胰島素的國際參考品問世、胰島素在體內分子形式的不均一性、檢測過程中的交叉反應等因素，常導致不同檢測系統(tǒng)間的結果的差異較大。本課題組前期研究［1］用3種化學發(fā)光系統(tǒng)檢測血清的研究結果初步顯示，不同檢測系統(tǒng)間其水平差異非常顯著。同時發(fā)現(xiàn)，可能存在獨立于不同檢測系統(tǒng)的通用參數(shù)。本文通過大樣本、多種檢測系統(tǒng)進行進一步的論證。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

化學發(fā)光檢測方法為直接化學發(fā)光免疫分析法(chemiluminescent immunoassay，CLIA)、電化學發(fā)光免疫分析法(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)、微粒子化學發(fā)光免疫分析法(chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA)和化學發(fā)光酶免疫分析法(chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA)。CLIA、ECLIA和CMI依次采用拜耳公司的ADVIA Centaur全自動分析系統(tǒng)、羅氏公司的Cobas e411全自動分析系統(tǒng)和亞培公司i－2000全自動分析系統(tǒng)，CLEIA采用北京源德生物醫(yī)學工程公司的半自動分析系統(tǒng)(CLEIA－1)和北京科美公司的CHEMCLIN－6000全自動分析系統(tǒng)(CLEIA－2)。檢測所用的定標液、質控品、試劑盒均為各檢測系統(tǒng)的配套產品。

1.2 標本來源

臨床血清標本來自首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院檢驗科收集的100名未使用外源性胰島素治療的住院患者，其中，男性50名，女性50名，所有患者均按照口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test，OGTT)的要求于空腹、服糖后 0.5、1、2 和 3 h 分別采集3 mL靜脈血，共計500份標本。離心后及時分離、分裝血清，置于－80℃冰箱凍存，并于同一時間復溶后完成所有測定。

1.3 檢測方法

對每個標本，分別采用上述5種檢測系統(tǒng)測定每個患者空腹及服糖后各時間點血清INS濃度，每次測定均同時測定室內質控品進行質量監(jiān)測。所有測定均在實驗室可控范圍內，并嚴格按試劑盒的說明進行。血清INS的濃度單位為mIU/L。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，以OGTT中空腹和服糖后各時間點血清INS絕對值、服糖后各時間點INS濃度分別與其各自空腹?jié)舛鹊谋戎禐橛^察指標，不同檢測系統(tǒng)INS水平分組并進行兩兩比較。非正態(tài)分布的配對數(shù)據(jù)，多組間總體比較用Friedman檢驗，兩兩比較做Wilcoxon配對秩和檢驗，相關分析用Spearman相關分析，并進行回歸與曲線估計，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同系統(tǒng)檢測血清INS結果現(xiàn)狀分析

2.1.1 不同檢測系統(tǒng)間血清胰島素水平的差異性分析

經正態(tài)性檢驗，所有指標均不符合正態(tài)性分布(P均為0.000)。各種檢測系統(tǒng)所測定的血清INS水平以四分位數(shù)M(P25，P75)描述。

經Friedman秩和檢驗分時段比較顯示，整體上5種不同的檢測系統(tǒng)間在不同的時間點，血清胰島素水平差異均有統(tǒng)計學意義(P均為0.000)，詳見表1。

2.1.2 不同檢測系統(tǒng)間血清胰島素水平及“比值”的關系

經Spearman秩相關分析，任意兩個檢測系統(tǒng)間血清INS水平都存在非常顯著的相關關系(P均為0.000)。經回歸及曲線估計，除CLEIA2外，任意兩種檢測系統(tǒng)間均符合直線相關關系(P均為0.000)。而由CLEIA2測得的INS水平與其他任意一種檢測系統(tǒng)的擬合曲線均更為顯著地符合二次方程關系(P均為0.000)。

表1 5種不同檢測系統(tǒng)血清胰島素水平統(tǒng)計描述及差異性分析Tab.1 Statistical description of serum insulin level and difference among 5 systems

對每位患者OGTT服糖后各時間點INS水平分別與其自身空腹水平的“比值”，在不同檢測系統(tǒng)間行Spearman秩相關分析。結果顯示，任意兩個檢測系統(tǒng)間，都存在顯著的相關關系(P均為0.000)。經回歸及曲線估計顯示，任意兩個檢測系統(tǒng)“比值”的擬合曲線更符合二次方程關系(二次方程的R2比一次方程的值更高，且P均為0.000)。同使用INS直接回歸相比，除檢測系統(tǒng)CLEIA1分別與其他各檢測系統(tǒng)的散點圖更加發(fā)散外(R2分別為0.443，0.553，0.591，0.599)，其余各檢測系統(tǒng)間“比值”的散點圖則更為集中(R2有不同程度的增高)。

2.2 不同檢測系統(tǒng)間血清胰島素水平(Ins)及“比值”(Ins-R)的分時段兩兩比較

2.2.1 不同檢測系統(tǒng)間分時間點比較，“比值”間的統(tǒng)計學描述和整體上的差異性分析

如表2所示，各種檢測系統(tǒng)所測定的血清INS“比值”以M(P25，P75)方式描述。經Friedman秩和檢驗顯示，分別對不同的時間點而言，整體上5種不同的檢測系統(tǒng)間血清胰島素“比值”差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，詳見表2。

表2 5種不同檢測系統(tǒng)血清胰島素“比值”的統(tǒng)計描述及整體上差異性分析Tab.2 Statistical description of serum insulin ratio and difference among 5 systems

2.2.2 不同檢測系統(tǒng)間分時間點兩兩比較，“比值”間相關性和差異性

對100例患者而言，每位患者服糖前后均抽取5次標本，分別對每個抽血時間點的血清INS水平以及“比值”進行兩個檢測系統(tǒng)間的相關性分析和差異性比較(Wilcoxon配對秩和檢驗)。

結果顯示，無論對每個時間點的INS水平還是“比值”，任意兩個檢測系統(tǒng)間均存在非常顯著的相關關系(P均為0.000)。

對于INS水平而言，在空腹時，ECLIA同 CLIA、CMIA同CLIA兩組檢測系統(tǒng)間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.562和0.935)。對餐后3 h而言，ECLIA同CLIA兩個檢測系統(tǒng)間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.440)。其他各時間點，任意兩個檢測系統(tǒng)間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

對于“比值”而言，CLEIA2同ECLIA間餐后0.5 h比較，差異無統(tǒng)計學意義;CLEIA2同CMIA兩個檢測系統(tǒng)間餐后1.0、2.0和3.0 h差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。而其余各時間點，任意兩個檢測系統(tǒng)間差異均有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)，詳見表3。

3 討論

鑒于胰島素和C－肽在反映有關胰腺β細胞相關疾病方面的獨特價值，已成為臨床常規(guī)檢測的實驗項目。但迄今在臨床普及和使用過的檢測方法，從經典的放射免疫分析技術、酶免疫分析技術、到如今廣泛應用的各種類型的化學發(fā)光免疫分析技術，都基于免疫學原理。由于INS和C－P在體內分子形式的不均一性、交叉反應以及無統(tǒng)一的國際參考品［2］，導致不同檢測系統(tǒng)間測定結果客觀上存在較大差異性的事實，這限制了臨床資料的可比性，以及根據(jù)測定結果進行的臨床實踐活動。所以積極去發(fā)現(xiàn)不同檢測系統(tǒng)間存在的內在規(guī)律，是臨床工作的迫切需求。

表3 不同檢測系統(tǒng)間胰島素水平(Ins)及“比值”(Ins-R)的分時段比較Tab.3 Comparison of insulin(Ins)and“ratios”(Ins-R)in temporal manner

血清胰島素水平在各檢測系統(tǒng)間存在著較大的差異，由本研究的回歸方程顯示，其他檢測系統(tǒng)測定值基本是CLEIA1的1.5～2.0倍。而其他檢測系統(tǒng)間也相差百分之幾到百分之三十左右。既然如此，是否各種檢測系統(tǒng)得到的胰島素測定值就完全不同通用了呢?本研究結果顯示，在空腹水平時，ECLIA同 CLIA、CMIA同CLIA 2組檢測系統(tǒng)間可以認為是通用的。對餐后3 h而言，ECLIA同CLIA 2個檢測系統(tǒng)間可以認為是互通的。其他各時間點，任意兩個檢測系統(tǒng)間則完全不能互通?；谝陨鲜聦?，我們可以得出結論，即有些檢測系統(tǒng)間對于較低濃度的胰島素測定值還是可以通用的。而隨著胰島素水平的增高，不同檢測系統(tǒng)間的差異性得到了放大，以至于2種檢測系統(tǒng)間的測定數(shù)據(jù)完全不能通用和替代。

由于臨床上常將某患者服糖后測定的胰島素水平與空腹水平進行比較，以此判定胰腺的功能。為此，我們將某位患者服糖后的胰島素水平與其空腹水平相比，得到一個“比值”，看不同檢測系統(tǒng)間此校正后的參數(shù)是否可以通用。先前的小樣本研究［1］顯示，該參數(shù)可能是較為有前途的。為此，我們進行了此次大樣本的研究。本研究顯示，對于“比值”而言，檢測系統(tǒng)CLEIA2同ECLIA間餐后0.5 h比較，差異無統(tǒng)計學意義;CLEIA2同CMIA 2個檢測系統(tǒng)間餐后1.0、2.0和3.0 h比較，差異無統(tǒng)計學意義。而其余各時間點，任意2個檢測系統(tǒng)間差異均有統(tǒng)計學意義。由此本研究得出結論，即“比值”也不是放之四海皆準的通用參數(shù)，而也是與特定的檢測系統(tǒng)、特定的時間點相關聯(lián)。

雖然各種檢測系統(tǒng)的血清胰島素的測定水平并不是完全等同的，但其無論是絕對值還是“比值”，從整體上還是分時段分析上，任意2種檢測系統(tǒng)間均存在高度的相關性(P均為0.000)。整體上，對胰島素的絕對水平在任意2個檢測系統(tǒng)間的回歸分析顯示，R2由0.690～0.957。這說明5種系統(tǒng)在檢測臨床標本時，其測定結果能夠較為一致地反映血清胰島素在OGTT中的變化趨勢及峰值出現(xiàn)的時間。相關性最好的2個檢測系統(tǒng)是ECLIA和CMIA，R2達到0.957。也就是說，其結果的相互轉換基本上可以按照回歸方程進行換算。

本研究發(fā)現(xiàn)了一個較為奇特的現(xiàn)象，即血清胰島素水平在不同的檢測系統(tǒng)間，其符合的數(shù)學模型可能是不同的。對于CLEIA2以外的4個檢測系統(tǒng)，任意2個之間均較好的符合直線相關關系。而CLEIA2則與其他任意一個檢測系統(tǒng)更為符合二次方程曲線數(shù)學模型。這在以往的文獻中很少見到。這個發(fā)現(xiàn)對我們比較兩種檢測系統(tǒng)的測定結果具有一定的指導意義。

同使用胰島素絕對值直接回歸所得到的曲線相比，對“比值”的研究顯示，CLEIA1分別與其他各檢測系統(tǒng)的散點圖更加發(fā)散外，其余各檢測系統(tǒng)間“比值”的散點圖則更為集中(R2有不同程度的增高)。而且所有檢測系統(tǒng)間的比值均呈現(xiàn)二次方程的數(shù)學模型關系。從此可以看出，雖然“比值”并非存在于各個檢測系統(tǒng)間的完全通用的參數(shù)，但至少是比絕對值更好的、可用于不同檢測系統(tǒng)間進行更有效比較的參數(shù)。

為了解決不同檢測系統(tǒng)間或臨床實驗室的測定結果間存在的客觀的、顯著的差異，建立和完善檢測血清胰島素、C－肽的標準化參考系統(tǒng)，是解決問題的關鍵。這在國外的相關研究［3－7］中也引起了高度關注，并且已經取得了一定的成果［8－10］。我們期待著成熟的國際標準品問世，并能夠應用于臨床實踐。

［1］張燃星，劉健彬，譚延國.幾種化學發(fā)光法檢測系統(tǒng)測定血清胰島素的臨床效果評價［J］.中華臨床醫(yī)師雜志:電子版，2010，4(11):2218－2221.

［2］Sapin R.Insulin assays:previously known and new analytical features［J］.Clin Lab，2003，49(3－4):113－121.

［3］Marcovina S，Bowsher R R，Miller W G，et al.Standardization of insulin immunoassays:report of the American Diabetes Association work group［J］.Clin Chem，2007，53(4):711－716.

［4］Manley S E，Stratton I M，Clark P M，et al.Comparison of 11 human insulin assays:implications for clinical investigation and research［J］.Clin Chem，2007，53(5):922－932.

［5］Wiedmeyer H M，Polonsky K S，Myers G L，et al.International comparison of c－peptide measurements［J］.Clin Chem，2007，53(4):784－787.

［6］Little R R，Rohlfing C L，Tennill A L，et al.Standardization of C－Peptide measurements［J］.Clin Chem，2008，54(6):1023－1026.

［7］Miller W G，Thienpont L M，Van Uytfanghe K，et al.Toward standardization of insulin immunoassays［J］.Clin Chem，2009，55(5):1011－1018.

［8］Cabaleiro D R，St?ckl D，Kaufman J M，et al.Feasibility of standardization of serum C－peptide immunoassays with isotope－dilution liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.Clin Chem，2006，52(6):1193－1196.

［9］Cabaleiro D R，Uytfanghe K V，Stove V，et al.Pilot Study for the Standardization of insulin immunoassays with isotope dilution－liquid chromatography/tandem massspectrometry［J］.Clin Chem，2007，53(8):1462－1469.

［10］崔常清.胰島素抵抗的機制與臨床研究進展［J］.中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志，2012，15(7):1119－1121.