楊樹琳 阮祥燕 蔣 輝 王 迎

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100026;2.首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，北京100069)

△作者現(xiàn)單位，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院京西院區(qū)婦產(chǎn)科

流行病學(xué)認(rèn)為激素替代治療(hormone replacement therapy，HRT)不應(yīng)用于已經(jīng)罹患動(dòng)脈粥樣硬化的女性［1］，但是否可應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化的一級(jí)預(yù)防結(jié)果存在爭(zhēng)議［1－2］。血管慢性炎性反應(yīng)過程被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的中心環(huán)節(jié)［3］。C反應(yīng)蛋白(C－reactive protein，CRP)、白介素 6(interleukin－6，IL－6)目前被公認(rèn)為慢性低度炎性反應(yīng)的標(biāo)志物［4－6］，即使調(diào)整生活方式和代謝危險(xiǎn)因素仍可作為炎性反應(yīng)標(biāo)志物。多項(xiàng)研究［7］顯示CRP是2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化與心血管事件的預(yù)測(cè)因素。戊酸雌二醇是臨床上常用的天然口服雌激素，本研究采用雌性自然更年期Sprague－Dawley(SD)大鼠建立自然絕經(jīng)模型，探討戊酸雌二醇灌胃給藥對(duì)自然更年期大鼠血清超敏C反應(yīng)蛋白(high sensitivity C－reactive protein，hs－CRP)與IL－6水平的影響，為絕經(jīng)期婦女激素補(bǔ)充提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

15月齡健康無特殊病原體(specific－pathogen free，SPF)級(jí)雌性SD大鼠70只，體質(zhì)量330～520 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2006－0009〕。SD大鼠飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物室，室溫22℃ ～26℃，濕度為40% ～60%，晝夜明暗交替時(shí)間比為12 h∶12 h，自由飲水和采食，房間定時(shí)通風(fēng)消毒。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(MULTISKAN MK3，Thermo，USA)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH4000A，天津泰斯特公司)，大鼠雌二醇(E2)ELISA試劑盒ESBL4287(美國(guó)EVER 公司)，大鼠卵泡刺激素(follicle－stimulating hormone，F(xiàn)SH)ELISA試劑盒 RE056(美國(guó) Biosource公司)，大鼠超敏C反應(yīng)蛋白(hs－CRP)ELISA試劑盒ESBL4484(美國(guó) EVER公司)，大鼠白介素6(IL－6)ELISA試劑盒R6000B(美國(guó)RD公司)。

1.3 藥物及用量

戊酸雌二醇(廣州先靈藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字J20080036)。大鼠灌胃計(jì)算公式參照文獻(xiàn)［8］:戊酸雌二醇劑量(mg·kg－1)=6.25 ×2/60(mg·kg－1)≈0.21 mg·kg－1。戊酸雌二醇用無菌 0.9% 氯化鈉注射液配制成戊酸雌二醇混懸液。動(dòng)物每周定時(shí)測(cè)體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量計(jì)算每只大鼠每次需要灌胃量。

1.4 方法

1.4.1 樣本量計(jì)算

1.4.2 動(dòng)物模型的制備及分組

1)動(dòng)物模型的制備:9月齡大鼠100只，每天定時(shí)取大鼠陰道脫落細(xì)胞于光學(xué)顯微鏡下觀察。正常育齡期大鼠有規(guī)律動(dòng)情周期:包括動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期和動(dòng)情間期［9］。根據(jù)陰道細(xì)胞形態(tài)判斷大鼠動(dòng)情周期存在狀態(tài)［10］。動(dòng)情前期:以底層細(xì)胞即圓核上皮細(xì)胞為主，少量的角化細(xì)胞和粒細(xì)胞;動(dòng)情期:角化上皮細(xì)胞為主;動(dòng)情后期:主要為粒細(xì)胞和角化細(xì)胞;動(dòng)情間期:粒細(xì)胞為主，少量有核上皮細(xì)胞和黏液。連續(xù)觀察36個(gè)動(dòng)情周期(6個(gè)月，從9月齡至15月齡)后，篩選出陰道脫落細(xì)胞檢查呈持續(xù)無角化狀態(tài)，動(dòng)情周期消失(預(yù)示即將或已經(jīng)進(jìn)入更年期)的70只大鼠，以自然老化法建立自然更年期模型大鼠建立。

2)分組:為排除實(shí)驗(yàn)時(shí)體質(zhì)量干擾，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠按體質(zhì)量排序，采用數(shù)字表法隨機(jī)分組［11］，將大鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組35只。分組后，以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)2組大鼠平均體質(zhì)量進(jìn)行兩兩比較，實(shí)驗(yàn)開始前實(shí)驗(yàn)組大鼠體質(zhì)量為(420.16±24.76)g，對(duì)照組為(419.96±23.84)g，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

大鼠喂養(yǎng)1周適應(yīng)后，實(shí)驗(yàn)組大鼠開始用戊酸雌二醇0.9%氯化鈉注射液混懸液(1 mg戊酸雌二醇溶于10 mL 0.9%氯化鈉注射液中制成混懸液)按照2.1 mL·kg－1灌胃，對(duì)照組給予等量0.9%氯化鈉注射液。實(shí)驗(yàn)組灌胃期間意外死亡1只，對(duì)照組在此期間也意外死亡1只。2組大鼠每天灌胃1次，灌胃14周后腹主動(dòng)脈取血后處死，血液標(biāo)本經(jīng)3 500 r·min－1離心10 min，取血清于1.5 mL EP管中，－80℃冰箱保存待測(cè)。

1.4.3 性激素、hs－CRP 及 IL－6 檢測(cè)

競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血清雌二醇(estradiol，E2)和卵泡刺激素(follicle－stimulating hormone，F(xiàn)SH)濃度以及hs－CRP及IL－6水平。終止反應(yīng)后30 min內(nèi)，檢測(cè)450 nm吸光度。所有檢測(cè)均按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng) One－Sample Kolmogorov－Smirnov 檢驗(yàn)其是否符合正態(tài)分布，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉ±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠灌胃14周各檢測(cè)指標(biāo)正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果

灌胃14周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各檢測(cè)指標(biāo)均符合正態(tài)性分布(P＞0.05)，詳見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各檢測(cè)指標(biāo)正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Normality distribution result of each index in the two groups

2.2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠E2和FSH水平比較

灌胃14周，實(shí)驗(yàn)組血清E2水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組血清FSH水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠灌胃14周血清E2、FSH水平比較Tab.2 The comparison of E2 and FSH levels in the rats of treatment and control groups(ˉ±s，n=34)

表2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠灌胃14周血清E2、FSH水平比較Tab.2 The comparison of E2 and FSH levels in the rats of treatment and control groups(ˉ±s，n=34)

* P ＜0.05 vs control group;E2:estradiol;FSH:folliclestimulating hormone.

Group E2/(ng·L－1) FSH/(IU·L－1)Treatment 61.831±10.950* 3.887±2.070*Control 55.653±7.716 5.292±2.472

2.3 灌胃14周，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠血清hs-CRP水平比較

灌胃14周，自然更年期大鼠實(shí)驗(yàn)組血清hs－CRP水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，詳見表3。

表3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠灌胃14周hs-CRP水平比較Tab.3 The comparison of hs-CRP levels in the rats of treatment and control groups(ˉ±s，n=34)

表3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠灌胃14周hs-CRP水平比較Tab.3 The comparison of hs-CRP levels in the rats of treatment and control groups(ˉ±s，n=34)

* P ＜0.05 vs control group;hs-CRP;high sensitivity C－reactive protein.

Group hs－CRP/(pg·mL －1)Treatment 130.18±55.96*0.000 Control 190.82±80.73 P

2.4 灌胃14周，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠IL-6水平比較

灌胃14周，自然更年期大鼠實(shí)驗(yàn)組血清IL－6較對(duì)照組有降低趨勢(shì)(P＞0.05)，但兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見表4。

表4 灌胃14周兩組大鼠血清IL-6水平的比較Tab.4 The comparison of IL-6 levels in the rats of treatment and control groups(ˉ±s，n=34)

表4 灌胃14周兩組大鼠血清IL-6水平的比較Tab.4 The comparison of IL-6 levels in the rats of treatment and control groups(ˉ±s，n=34)

IL-6:interleukin－6.

Group IL－6/(pg·mL －1)Treatment 44.65±40.28 Control 49.66±22.71 P 0.549

3 討論

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病(以下簡(jiǎn)稱冠心病)是絕經(jīng)女性死亡的主要原因。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)冠心病是慢性炎性反應(yīng)性疾病［12］，研究［13］結(jié)果表明女性隨著激素水平的下降，促炎性反應(yīng)的水平會(huì)升高。本研究選擇與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)的炎性反應(yīng)因子 hs－CRP 和 IL－6，絕經(jīng)婦女 hs－CRP 水平的研究一直是研究的熱點(diǎn)，但結(jié)論尚有爭(zhēng)議［14］，考慮 hs－CRP是一種非特異性的炎性反應(yīng)因子，受機(jī)體多方面影響。本研究結(jié)果顯示自然更年期大鼠體內(nèi)hs－CRP水平升高，雌激素補(bǔ)充可以降低自然更年期大鼠血清hs－CRP的水平，不影響自然更年期大鼠血清IL－6的水平。

hs－CRP是在感染和組織損傷時(shí)血漿中快速升高的主要急性期蛋白之一，它由肝臟細(xì)胞合成并可在其他局部組織及部位(如動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中)的部分細(xì)胞內(nèi)合成。hs－CRP的檢測(cè)具有敏感、準(zhǔn)確和可重復(fù)性的特點(diǎn)，在冠心病、腦卒中、周圍血管栓塞等疾病診斷和預(yù)測(cè)中發(fā)揮越來越重要的作用［15－16］。近年流行病學(xué)研究［17］結(jié)果證實(shí)，hs－CRP與左室肥厚、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、胰島素抵抗密切相關(guān)，并可預(yù)測(cè)冠心病、腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后［18］。絕經(jīng)女性體內(nèi)雌激素的降低同時(shí)伴隨體內(nèi)hs－CRP的升高會(huì)使絕經(jīng)女性相對(duì)更加脆弱［19］。2004年，美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心(CDC)與美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)(AHA)聯(lián)合發(fā)表炎性反應(yīng)標(biāo)志物與心血管疾病指南［20］，認(rèn)為 hs－CRP在缺血性心臟病中是一種可靠和重要的標(biāo)志物，美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)推薦hs－CRP水平為評(píng)價(jià)冠心病人群危險(xiǎn)度分層的依據(jù)之一，其中hs－CRP≥3 mg/L為高危人群的標(biāo)準(zhǔn)，hs－CRP超過20 mg/L需要考慮有無感染等其他非冠心病因素存在。

白細(xì)胞介素－6(IL－6)是相對(duì)分子質(zhì)量為26 000的糖蛋白，主要由單核、巨噬細(xì)胞分泌，是肝臟急性時(shí)相反應(yīng)的有力誘導(dǎo)劑，是肝臟C反應(yīng)蛋白的主要刺激因子，作為重要的促炎性反應(yīng)細(xì)胞因子，其在心血管等相關(guān)慢性病中的作用受到越來越多的關(guān)注。實(shí)驗(yàn)研究［21］表明IL－6可通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的趨化因子和黏附分子的表達(dá)、釋放，促進(jìn)白細(xì)胞浸潤(rùn)，削弱內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性一氧化氮的能力，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞攝取氧化型低密度脂蛋白形成泡沫細(xì)胞，上調(diào)編碼卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶及載脂蛋白A－I的基因表達(dá)，致動(dòng)脈粥樣硬化損害的發(fā)展，對(duì)遠(yuǎn)期心血管事件具有預(yù)測(cè)價(jià)值［22］。臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［23］也均已證實(shí)，急性心肌梗死后IL－6血清濃度增高。雌激素對(duì)IL－6的影響結(jié)果存在爭(zhēng)議，有橫斷面研究［24］闡明絕經(jīng)婦女較絕經(jīng)前婦女IL－6水平無明顯差異。Wakatsuki等［25］針對(duì)結(jié)合雌激素的研究發(fā)現(xiàn)血清炎性反應(yīng)因子包括IL－6與雌激素劑量相關(guān)，大劑量可升高炎性反應(yīng)因子水平，而低劑量則不會(huì)對(duì)血清炎性反應(yīng)因子有影響。本研究發(fā)現(xiàn)自然更年期大鼠實(shí)驗(yàn)組血清IL－6較對(duì)照組有降低趨勢(shì)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測(cè)本實(shí)驗(yàn)所用臨床常用雌二醇換算劑量給予大鼠灌胃給藥并沒有升高自然更年期大鼠血清IL－6的水平。激素補(bǔ)充治療對(duì)絕經(jīng)婦女hs－CRP及IL－6水平的影響與激素種類、劑量及給藥途徑有關(guān)，口服戊酸雌二醇后可降低自然更年期大鼠血清hs－CRP水平，不升高IL－6水平，從而有利于降低心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，為臨床激素補(bǔ)充治療提供一些理論參考。

［1］Mosca L，Collins P，Herrington D M，et al.Hormone replacement therapy and cardiovascular disease:a statement for healthcare professionals from the American Heart Association［J］.Circulation，2001，104(4):499－503.

［2］M?kel? R，Dastidar P，Jokela H，et al.Effect of longterm hormone replacement therapy on atherosclerosis progression in postmenopausal women relates to myeloperoxidase promoter polymorphism［J］.J Clin Endocrinol Metab，2003，88(8):3823－3828.

［3］Libby P，Ridker P M，Maseri A.Inflammation and atherosclerosis［J］.Circulation，2002，105(9):1135－1143.

［4］Bassuk S S，Rifai N，Ridker P M.High－sensitivity C－reactive protein:clinical importance［J］.Curr Probl Cardiol，2004，29(8):439－493.

［5］Libby P，Ridker P M.Inflammation and atherosclerosis:role of C－reactive protein in risk assessment［J］.Am J Med，2004，116(suppl.6A):9S－16S.

［6］Kishimoto T.IL－6 from its discovery to clinical applications［J］.Int Immunol，2010，22(5):347－352.

［7］Emerging Risk Factors Collaboration，Kaptoge S，Di Angelantonio E，et al.C－reactive protein，fibrinogen，and cardiovascular disease prediction［J］.N Engl J Med，2012，367(14):1310－1320.

［8］施新酞.醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)學(xué)［M］.西安:陜西科學(xué)技術(shù)出版社，1989.418－420.

［9］Marcondes F K，Bianchi F J，Tanno A P.Determination of the estrous cycle phases of rats:some helpful considerations［J］.Braz J Biol，2002，62(4A):609－614.

［10］Ziegler D R，Gallagher M.Spatial memory in middle－aged female rats:Assessment of estrogen replacement after ovariectomy［J］.Brain Res，2005，1052(2):163－173.

［11］黎強(qiáng)，韋明.《用統(tǒng)計(jì)分析軟件隨機(jī)抽樣與隨機(jī)分組的方法》介紹的完全隨機(jī)分組方法對(duì)70只大鼠進(jìn)行分組.

［12］Danesh J，Whincup P，Walker M，et al.Low grade inflammation and coronary heart disease:prospective study and updated meta－analyses［J］.Bm J，2000，321(7255):199－204.

［13］Silva D C，Costa L O，Vasconcelos A A，et al.Waist circumference and menopausal status are independent predictors of endothelial low－grade inflammation［J］.Endocr Res，2013 Jun 17［Epub ahead of print］.

［14］Lee C G，Carr M C，Murdoch S J，et al.Adipokines，inflammation，and visceral adiposity across the menopausal transition:a prospective study［J］.J Clin Endocrinol Metab，2009，94(4):1104－1110.

［15］徐鴻翔，周諒，胡偉，等.高敏c反應(yīng)蛋白與高血壓的關(guān)系［J］.中國(guó)心血管病研究，2010，8(3):208－210.

［16］吳銀燕，殷紅兵.超敏C反應(yīng)蛋白和脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2與缺血性卒中的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)腦血管病雜志，2012，9(2):107－112.

［17］Liu S W，Qiao S B，Yuan J S，et al.Association of plasma visfatin levels with inflammation，atherosclerosis and acute coronary syndromes(ACS)in humans［J］.Clin Endocrinol(Oxf)，2009，71(2):202－207.

［18］Song I U，Kim Y D，Kim J S，et al.Can high－sensitivity C－reactive protein and plasma homocysteine levels independently predict the prognosis of patients with functional disability after first－ever ischemic stroke?［J］.Eur Neurol，2010，64(5):304－310.

［19］Carcaillon L，García－García F J，Tresguerres J A，et al.Higher levels of endogenous estradiol are associated with frailty in postmenopausal women from the toledo study for healthy aging［J］.J Clin Endocrinol Metab，2012，97(8):2898－2906.

［20］Biasucci L M，CDC，AHA.CDC/AHA Workshop on Markers of Inflammation and Cardiovascular DiSease:Application to Clinical and Public Health Practice:clinical use of inflammatory markers in patients with cardiovascular disease:a background paper［J］.Circulation，2004，110(25):e560－e567.

［21］Comini L，Pasini E，Bachetti T，et al.Acute haemodynamic effects of IL－6 treatment in vivo:Involvement of vagus nerve in NO－mediated negative inotropism［J］.Cytokine，2005，30(5):236－242.

［22］Harris T B，F(xiàn)errucci L，Tracy R P，et al.Associations of elevated interleukin－6 and C－reactive protein levels with mortality in the elderly［J］.Am J Med，1999，106(5):506－512.

［23］Vakili H，Ghaderian S M，Akbarzadeh Najar R，et al.Genetic polymorphism of interleukin－6 gene and susceptibility to acute myocardial infarction［J］.Coron Artery Dis，2011，22(5):299－305.

［24］趙曉東.雌激素、IL－6與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的相關(guān)性研究［D］.濟(jì)南:山東大學(xué)，2003.

［25］Wakatsuki A，Ikenoue N，Shinohara K，et al.Effect of lower dosage of oral conjugated equine estrogen on inflammatory markers and endothelial function in healthy postmenopausal women［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24(3):571－576.