李 穎 范爾鐘 伯銘羽 王向東 張 羅*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，北京100005;2.北京市耳鼻咽喉科研究所，耳鼻咽喉頭頸科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鼻病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100005)

呼吸道的黏膜上皮細(xì)胞構(gòu)成了機(jī)體與外界環(huán)境的第一道屏障，上皮黏膜細(xì)胞與細(xì)胞之間通過(guò)各種細(xì)胞連接緊密聯(lián)系在一起，包括緊密連接(tight junctions，TJs)、黏附連接(adherens junctions，AJs)、縫隙連接(gap junctions)以及橋粒(desmosomes)［1］。當(dāng)在感染、炎性反應(yīng)等條件下，細(xì)胞連接被擾亂，上皮屏障功能被破壞。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)緊密連接蛋白(zonular occludens－1，ZO－1)、黏附連接蛋白(E－cadherin)和橋粒連接蛋白(desmoglein－1，dsg－1)在不同類型慢性鼻竇炎中的表達(dá)，旨在探究細(xì)胞連接蛋白表達(dá)的改變與上皮屏障功能的破壞及上皮組織重塑的關(guān)系，和其在慢性鼻竇炎發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2010年12月至2012年8月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院行鼻內(nèi)鏡手術(shù)的患者標(biāo)本60例。不伴鼻息肉的慢性鼻竇炎(chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP)患者(CRSsNP 組)15例，伴鼻息肉的慢性鼻竇炎(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)患者(CRSwNP 組)30 例，對(duì)照鼻中隔偏曲患者(control組)15例。所有患者術(shù)前2周均未應(yīng)用糖皮質(zhì)類固醇激素及抗生素，并排除有變應(yīng)性真菌性鼻－鼻竇炎、原發(fā)性不動(dòng)纖毛綜合征、囊性纖維化疾患的患者。CT提示CRSsNP組患者無(wú)鼻息肉性疾病，對(duì)照組患者無(wú)鼻竇炎性疾病。術(shù)中取CRSsNP組患者鉤突或鼻竇黏膜組織、CRSwNP組患者息肉組織和對(duì)照組患者中鼻甲黏膜組織。所有患者術(shù)前均簽署知情同意書，本研究經(jīng)過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 蘇木精-伊紅(HE)染色

所有標(biāo)本均用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片厚4 μm對(duì)石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化后，蘇木精染色10 min，分化、返藍(lán)，伊紅染色3 min，脫水、透明、封片。HE染色切片用于組織形態(tài)學(xué)觀察和對(duì)組織的總炎性細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)并計(jì)算嗜酸性粒細(xì)胞占總炎性細(xì)胞的百分比，根據(jù)文獻(xiàn)［2］將本研究中對(duì)照組嗜酸性粒細(xì)胞的平均百分比與兩倍標(biāo)準(zhǔn)差之和(2.58%+2×1.55%=5.68%，約為6%)作為區(qū)分嗜酸性粒細(xì)胞性鼻息肉(Eos CRSwNP)和非嗜酸性粒細(xì)胞性鼻息肉(non－Eos CRSwNP)兩個(gè)亞型的標(biāo)準(zhǔn)，＞6%為嗜酸性粒細(xì)胞性鼻息肉，否則為非嗜酸性粒細(xì)胞性鼻息肉，兩組各15例。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

切片常規(guī)脫蠟至水，高壓抗原熱修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，5%脫脂奶粉封閉非特異性染色，兔抗多克隆抗體 ZO－1(1∶500，購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司)、鼠抗單克隆抗體E－cadherin(工作液，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、兔抗多克隆抗體 dsg－1(1 ∶500，購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz Blotechnology公司)4℃過(guò)夜。通用型二抗PV－6000(工作液，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)室溫40 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。陽(yáng)性染色細(xì)胞為胞膜或胞質(zhì)內(nèi)清晰的棕黃色顆粒。

1.4 結(jié)果判定

將染色結(jié)果在OlympusBX51顯微鏡下進(jìn)行半定量分析。采用免疫組織化學(xué)評(píng)分(immunohistochemical score，IHS)方法［3］，結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞百分比和陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度2個(gè)方面評(píng)分:a為陽(yáng)性細(xì)胞百分比(無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞占1% ～10%為1分，11% ～50%為2分，51% ～80%為3分，81% ～100%為4分);b為陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度(陰性為0分，弱陽(yáng)性為1分，中度陽(yáng)性為2分，強(qiáng)陽(yáng)性為3分)，a和b兩項(xiàng)乘積即為該例組織的IHS。3種連接蛋白表達(dá)情況以IHS表示，每張切片高倍鏡下選取上皮組織中5個(gè)不重復(fù)視野，取這5個(gè)視野的均數(shù)，并做統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析和LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本特征

60例樣本中，CRSsNP組鼻黏膜標(biāo)本15例，其中男12例，女3例，患者年齡17～70歲，平均年齡(43.5±16.6)歲;CRSwNP組鼻息肉標(biāo)本30例，其中男23例，女7例，患者年齡14～67歲，平均年齡(45.6±15.8)歲;對(duì)照組15例，其中男7例，女8例，患者年齡14～53歲，平均年齡(37.0±11.2)歲。

2.2 細(xì)胞連接的表達(dá)

3種細(xì)胞連接在不同組別鼻黏膜上皮中均可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，表現(xiàn)為胞膜或胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒沉積，且在上皮的上、中、下層均有表達(dá)。但各組的表達(dá)強(qiáng)弱和多少存在不同程度的差異。

在ZO－1的表達(dá)中，只有Eos CRSwNP組與對(duì)照組相比有明顯下降(P＜0.05);non－Eos CRSwNP組和CRSsNP組與對(duì)照組兩兩相比雖有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);兩個(gè)CRSwNP亞型之間，CRSw－NP亞型與CRSsNP組之間兩兩相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表 1，圖1)。

表1 不同組別鼻黏膜上皮中細(xì)胞連接的表達(dá)結(jié)果Tab.1 The expression of cell junction proteins from nasal epithelial cells under different conditions

圖1 緊密連接蛋白在不同組別鼻黏膜上皮中的表達(dá)情況(二步法免疫組織化學(xué)染色)Fig.1 The expression of ZO-1 from nasal epithelial cells(two-step immunohistochemical staining results)(400×)

在E－cadherin的表達(dá)中，兩個(gè)CRSwNP亞型以及CRSsNP組與對(duì)照組兩兩相比呈明顯上調(diào)表達(dá)(P＜0.05)，兩個(gè) CRSwNP亞型之間，CRSwNP亞型與CRSsNP組之間兩兩相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1，圖2)。

在 dsg－1的表達(dá)中，兩個(gè) CRSwNP亞型以及CRSsNP組與對(duì)照組兩兩相比明顯下調(diào)(P＜0.05)，并且兩個(gè)CRSwNP亞型與CRSsNP組兩兩相比也有明顯下調(diào)(P＜0.05)，但兩個(gè)CRSwNP亞型之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1，圖3)。

3 討論

上皮屏障是通過(guò)鄰近的細(xì)胞間由緊密連接(TJs)、黏附連接(AJs)、橋粒和縫隙連接組成的連接復(fù)合體緊密地聯(lián)系在一起來(lái)維持的［4］。TJs位于上皮細(xì)胞間連接的最頂部，是維持黏膜通透性的重要組成部分［5］。TJs由多種蛋白組成［6］，ZO－1(zonular occludens－1)是 1986 年發(fā)現(xiàn)的與 TJ 相關(guān)的蛋白［7］。其與維持和調(diào)節(jié)上皮籬笆和屏障功能有關(guān)，還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、維持上皮極性、細(xì)胞增生分化、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等重要過(guò)程。ZO－1是最具特征的胞質(zhì)緊密連接蛋白［8］。以膜結(jié)合蛋白丟失為特點(diǎn)的TJs的破壞，導(dǎo)致貫通上皮電阻的顯著減少和貫通上皮滲透性的明顯增加［9］。貫通上皮電位差的存在，表明鼻息肉患者屏障功能的改變［10］。

圖2 黏附鏈接蛋白在不同組別鼻黏膜上皮中的表達(dá)情況(二步法免疫組織化學(xué)染色)Fig.2 The expression of E-cadherin from nasal epithelial cells(two-step immunohistochemical staining results)(400×)

圖3 橋粒連接蛋白在不同組別鼻黏膜上皮中的表達(dá)情況(二步法免疫組織化學(xué)染色)Fig.3 The expression of dsg-1 from nasal epithelial cells(two-step immunohistochemical staining results)(400×)

AJs在上皮細(xì)胞間起著加強(qiáng)細(xì)胞間連接的功能。其中上皮鈣黏素(E－cadherin)是一類鈣依賴性跨膜糖蛋白，是AJ的主要成分。它與形態(tài)分化和細(xì)胞增生的控制、特定位置基因表達(dá)、形態(tài)發(fā)生、免疫功能、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、傷口愈合和炎性反應(yīng)有密切關(guān)系［11］。

橋粒存在于所有的上皮細(xì)胞以及某些特化的組織。其主要由兩類蛋白組成:一類是跨膜蛋白，主要由橋粒芯糖蛋白(desmoglein，dsg)和橋粒膠蛋白(desmocollin，dsc)構(gòu)成;另一類為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白，主要成分為橋粒斑蛋白(desmoplakin)和橋粒斑珠蛋白(plakoglobin)。其也起加強(qiáng)連接的作用。Dsg是橋粒的主要跨膜蛋白，是構(gòu)成細(xì)胞間橋粒的主要糖蛋白，分為 dsg－1、dsg－2 和 dsg－3。dsg－1 為 160 000 糖蛋白。一般認(rèn)為，dsg－1主要分布于正常表皮細(xì)胞的上部，被認(rèn)為系落葉性天皰瘡的主要靶抗原。Dsg－1的表達(dá)下調(diào)可能在角質(zhì)形成細(xì)胞的分化及腫瘤的發(fā)生中有一定的作用［12］。Spindler等［13］認(rèn)為，在正常表皮細(xì)胞的中、下部也可有dsg－1的明顯表達(dá)。

本研究探討了3種細(xì)胞連接在不同類型的慢性鼻竇炎上皮組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)TJs蛋白ZO－1和橋粒連接蛋白dsg－1與對(duì)照組相比呈下調(diào)表達(dá)，而AJs蛋白E－cadherin呈上調(diào)表達(dá)。Jang等［14］的研究顯示，在鼻息肉組織中，ZO－1隨上皮細(xì)胞增生和鱗狀化生程度的增加呈下調(diào)表達(dá)，而E－cadherin隨上皮細(xì)胞增生和鱗狀化生程度的增加呈上調(diào)表達(dá)。在本研究中，ZO－1的表達(dá)只有Eos CRSwNP組與對(duì)照組相比下降的程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中non－Eos CRSwNP組與對(duì)照組相比，差異也較明顯。因此，筆者將兩個(gè)CRSwNP亞型之和的總鼻息肉組與對(duì)照組進(jìn)行了比較，結(jié)果差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明在CRSsNP中，還不足以引起ZO－1表達(dá)的顯著變化。只有在鼻息肉組織中，才使ZO－1的表達(dá)產(chǎn)生明顯變化，Eos CRSw－NP的ZO－1表達(dá)比non－Eos CRSwNP更低一些，提示嗜酸性粒細(xì)胞可能在其中發(fā)揮一定作用，但由于每組例數(shù)較少(只有15例)，且2個(gè)CRSwNP亞型間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，還不足以說(shuō)明問(wèn)題，有待在今后的研究中探討詳盡機(jī)制。鼻息肉上皮中E－cadherin相對(duì)于正常黏膜的表達(dá)上調(diào)可以被認(rèn)為是一種補(bǔ)償現(xiàn)象，是為維持在炎性反應(yīng)條件下的正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)［15］。本研究結(jié)果也證實(shí)了這一現(xiàn)象，除了鼻息肉組的E－cadherin表達(dá)上調(diào)，CRSsNP組的E－cadherin表達(dá)也明顯上調(diào)，說(shuō)明E－cadherin的表達(dá)與鼻黏膜的炎性反應(yīng)程度和組織重塑程度呈正相關(guān)性。與對(duì)照組相比，dsg－1在鼻息肉組和 CRSsNP組的表達(dá)均明顯下調(diào)，且CRSwNP組也與CRSsNP組相比有明顯下降趨勢(shì)，但兩個(gè)CRSwNP亞型之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明隨黏膜炎性反應(yīng)程度的加劇，對(duì)dsg－1蛋白的破壞也逐漸增強(qiáng)，但嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)并沒(méi)有對(duì)其產(chǎn)生明顯影響。

在 Zuckerman 等［16］的研究中顯示，dsg－2、dsg－3 蛋白在人鼻息肉中的表達(dá)明顯低于正常鼻黏膜，而ZO－1和E－cadherin在這兩組中的表達(dá)卻沒(méi)有明顯區(qū)別。這可能與其病例的篩選和分組不同有關(guān)。在Zuckerman的研究中，將產(chǎn)生上皮鱗狀化生的鼻息肉組織排除在外，鼻息肉組包括有Samter’s三聯(lián)征患者，囊性纖維變性患者和變應(yīng)性真菌性鼻竇炎患者，其中有5人有已知過(guò)敏和2人接受了通常的免疫治療，且所有患者在手術(shù)前都接受了5天的類固醇激素治療。在另一研究［17］中，哮喘和過(guò)敏性疾病中可有橋粒表達(dá)的減弱，提示變態(tài)反應(yīng)對(duì)橋粒的表達(dá)是有影響的。但是也有研究［18］顯示，過(guò)敏性鼻炎的鼻黏膜中，緊密連接的蛋白表達(dá)、結(jié)構(gòu)和功能被很好地維持。

有研究證明在炎性腸疾?。?9］，過(guò)敏性炎性反應(yīng)［20－22］和病毒感染中［23］，TJs和 AJs 的破壞在其發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。由于每個(gè)研究者的研究角度、分類方法和所采用的檢測(cè)指標(biāo)及手段不同，研究結(jié)果也有一定差異。但對(duì)于上述原因可導(dǎo)致上皮屏障功能的破壞與改變，還是得到大多數(shù)研究的支持。關(guān)于上氣道炎性反應(yīng)疾病尤其是慢性鼻竇炎中細(xì)胞連接的作用報(bào)道較少，且多數(shù)研究者僅對(duì)鼻息肉與正常鼻黏膜進(jìn)行了比較。筆者在此項(xiàng)研究中，按組織的炎性反應(yīng)程度進(jìn)行了更為細(xì)致的分組，且將3種主要細(xì)胞連接中最具代表性的連接蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。通過(guò)對(duì)其表達(dá)改變情況的觀察和相互關(guān)系的分析，對(duì)鼻黏膜不同炎性反應(yīng)狀態(tài)下，細(xì)胞連接的改變有了更進(jìn)一步的了解，以期對(duì)慢性鼻竇炎發(fā)病機(jī)制的研究提供新的認(rèn)識(shí)。

［1］Chang E H，Pezzulo A A，Zabner J.Do cell junction pro－tein mutations cause an airway phenotype in mice or humans?［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2011，45(2):202－220.

［2］Cao P P，Li H B，Wang B F，et al.Distinct immunopathologic characteristics of various types of chronic rhinosinusitis in adult Chinese［J］.J Allergy Clin Immunol，2009，124(3):478－484.

［3］Soslow R A，Dannenberg A J，Rush D，et al.COX－2 is expressed in human pulmonary， colonic， and mammary tumors［J］.Cancer，2000，89(12):2637－2645.

［4］Liu Y，Nusrat A，Schnell F J，et al.Human junction adhesion molecule regulates tight junction resealing in epithelia［J］.J Cell Sci，2000，113(Pt13):2363－2374.

［5］Pizzuti D，Bortolami M，Mazzon E，et al.Transcriptional downregulation of tight junction protein ZO－1 in active coeliac disease is reversed after a gluten－free diet［J］.Dig Liver Dis，2004，36(5):337－341.

［6］K?hler K，Zahraoui A.Tight junction:a co－ordinator of cell signalling and membrane trafficking［J］.Biol Cell，2005，97(8):659－665.

［7］Stevenson B R，Siliciano J D，Mooseker M S，et al.Identification of ZO－1:a high molecular weight polypeptide associated with the tight junction(zonula occludens)in a variety of epithelia［J］.J Cell Biol，1986，103(3):755－766.

［8］Jesaitis L A，Goodenough D A.Molecular characterization and tissue distribution of ZO－2，a tight junction protein homologous to ZO－1 and the Drosophila discs－large tumor suppressor protein［J］.J Cell Biol，1994，124(6):949－961.

［9］Klingler C，Kniesel U，Bamforth S D，et al.Disruption of epithelial tight junctions is prevented by cyclic nucleotidedependent protein kinase inhibitors［J］.Histochem Cell Biol，2000，113(5):349－361.

［10］Bernstein J M，Gorfien J，Noble B，et al.Nasal polyposis:immunohistochemistry and bioelectrical findings(a hypothesis for the development of nasal polyps)［J］.J Allergy Clin Immunol，1997，99(2):165－175.

［11］Harrington K J，Syrigos K N.The role of E－cadherin－catenin complex:more than an intercellular glue?［J］.Ann Surg Oncol，2000，7(10):783－788.

［12］Harada H，Iwatsuki K，Ohtsuka M，et al.Abnormal desmoglein expression by squamous cell carcinoma cells［J］.Acta Derm Venereol，1996，76(6):417－420.

［13］Spindler V，Drenckhahn D，Zillikens D，et al.Pemphigus IgG causes skin splitting in the presence of both desmoglein 1 and desmoglein 3［J］.Am J Pathol，2007，171(3):906－916.

［14］Jang Y J，Kim H G，Koo T W，et al.Localization of ZO－1 and E－cadherin in the nasal polyp epithelium［J］.Eur Arch Otorhinolaryngol，2002，259(9):465－469.

［15］Demetter P，De Vos M，Van Damme N，et al.Focal upregulation of E－cadherin－catenin complex in inflamed bowel mucosa but reduced expression in ulcer－associated cell lineage［J］.Am J Clin Pathol，2000，114(3):364－370.

［16］Zuckerman J D，Lee W Y，DelGaudio J M，et al.Pathophysiology of nasal polyposis:the role of desmosomal junctions［J］.Am J Rhinol，2008，22(6):589－597.

［17］Shahana S，Jaunmuktane Z，Asplund M S，et al.Ultrastructural investigation of epithelial damage in asthmatic and non－asthmatic nasal polyps［J］.Respir Med，2006，100(11):2018－2028.

［18］Takano K，Kojima T，Go M，et al.HLA－DR－and CD11cpositive dendritic cells penetrate beyond well－developed epithelial tight junctions in human nasal mucosa of allergic rhinitis［J］.J Histochem Cytochem，2005，53(5):611－619.

［19］Fries W，Mazzon E，Squarzoni S，et al.Experimental colitis increases small intestine permeability in the rat［J］.Lab Invest，1999，79(1):49－57.

［20］Kobayashi N，Terada N，Hamano N，et al.Transepithelial migration of activated eosinophils induces a decrease of E－cadherin expression in cultured human nasal epithelial cells［J］.Clin Exp Allergy，2000，30(6):807－817.

［21］Takeuchi K，Kishioka C，Ishinaga H，et al.Histamine alters gene expression in cultured human nasal epithelial cells［J］.J Allergy Clin Immunol，2001，107(2):310－314.

［22］Wan H，Winton H L，Soeller C，et al.Quantitative structural and biochemical analyses of tight junction dynamics following exposure of epithelial cellsto house dust mite allergen Der p 1［J］.Clin Exp Allergy，2000，30(5):685－698.

［23］Dickman K G，Hempson S J，Anderson J，et al.Rotavirus alters paracellular permeability and energy metabolism in Caco－2 cells［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2000，279(4):G757－G766.