黎烈榮，余欣慧，蔣 平

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢430061；2.安徽省中醫(yī)院，安徽 合肥230031）

女性從開始出現(xiàn)絕經(jīng)趨勢(shì)到最后一次月經(jīng)，有一必經(jīng)的特殊生理階段，醫(yī)學(xué)上稱為絕經(jīng)過渡期，從進(jìn)入絕經(jīng)過渡期，下丘腦-垂體-卵巢性生殖軸功能便逐步衰老。我們?cè)谂R床中發(fā)現(xiàn)較多女性在35歲左右就開始出現(xiàn)月經(jīng)后期或月經(jīng)量少，標(biāo)志著進(jìn)入絕經(jīng)過渡期早期。我們認(rèn)為，中醫(yī)對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征的治療不應(yīng)僅限于癥狀出現(xiàn)之后，當(dāng)從更早時(shí)期開始進(jìn)行中藥干預(yù)，若以絕經(jīng)過渡期早期為切入點(diǎn)，相比在卵巢功能嚴(yán)重衰退時(shí)治療具有更好的療效。我們通過測(cè)定相關(guān)凋亡基因Caspase-3、Fas、Caspase-12、CytC蛋白在卵巢組織的表達(dá)，探討中藥通過影響卵巢Caspase依賴型凋亡通路，抑制卵巢老化進(jìn)程的作用機(jī)理，為在絕經(jīng)過渡期早期使用中藥，預(yù)防圍絕經(jīng)期綜合征提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材 料

動(dòng)物:所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為清潔級(jí)wistar雌性大鼠，由河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（豫）2005-0001。4～6月齡大鼠8只，體質(zhì)量（220±20）g，10月齡大鼠24只，體質(zhì)量（300±10）g，11～12月齡大鼠16只，體質(zhì)量（320±10）g。

藥物：益腎續(xù)經(jīng)湯由何首烏、肉蓯蓉、熟地、當(dāng)歸、雞血藤、黃芪、丹皮、牛膝等組成，生藥由河南省中醫(yī)院中藥房提供。去氧孕烯炔雌醇片（商品名媽富?。?，荷蘭歐加農(nóng)公司N.V.ORGANON，批號(hào)480940。中藥煎液和配制好的西藥水溶液均置于-20℃低溫冰箱冷藏保存。主要試劑和儀器：兩步法抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒（GENE TECH COMPANY LIMITED生產(chǎn)，貨號(hào)GK500705）。Rabbit Anti-Caspase-3（北京博奧森生物工程有限公司生產(chǎn)，貨號(hào)bs-0081R）。Rabbit Anti-Fas（北京博奧森生物工程有限公司生產(chǎn)，貨號(hào)bs-0215R）。Rabbit Anti-Cytochrome C（北京博奧森生物工程有限公司生產(chǎn)，貨號(hào)bs-0013R）。Rabbit Anti-Caspase-12（北京博奧森生物工程有限公司，貨號(hào)bs-1105R）。BM—II型組織包埋機(jī)，德國(guó)HM340 MICROM切片機(jī)，CS-B型攤片烤片機(jī)電熱恒溫干燥箱，OLYMPUS CHK 3F0200顯微鏡，計(jì)算機(jī)圖像分析儀。

2 方 法

2.1 造模

采用自然絕經(jīng)過渡期模型，以10月齡wistar雌性大鼠，陰道脫落細(xì)胞涂片表現(xiàn)為動(dòng)情間期延長(zhǎng)者作為絕經(jīng)過渡期早期模型。11～12月齡wistar雌性大鼠，陰道脫落細(xì)胞涂片表現(xiàn)為動(dòng)情周期紊亂、動(dòng)情間期延長(zhǎng)者，作為絕經(jīng)過渡期晚期模型。

2.2 分組與給藥

選取陰道脫落細(xì)胞涂片表現(xiàn)為3個(gè)規(guī)律動(dòng)情周期，且角化細(xì)胞比率高于50%的4～6月齡大鼠8只，做為青年對(duì)照組（青年組）；選取符合絕經(jīng)過渡期早期模型標(biāo)準(zhǔn)的10月齡大鼠24只，隨機(jī)分為絕經(jīng)過渡期早期模型組（MT早期模型組）、絕經(jīng)過渡期早期治療組（MT早期治療組）、西藥對(duì)照組（西藥組）3組，每組8只；選取符合絕經(jīng)過渡期晚期模型標(biāo)準(zhǔn)的11～12月齡大鼠16只，隨機(jī)分為絕經(jīng)過渡期晚期模型組（MT晚期模型組）、絕經(jīng)過渡期晚期治療組（MT晚期治療組），每組8只。共48只大鼠。

青年組、MT早期模型組、MT晚期模型組分別給予0.9%的生理鹽水。各給藥組給藥劑量均按照人鼠體表面積換算表計(jì)算，MT早期治療組、MT晚期治療組每日予以中藥益腎續(xù)經(jīng)湯，經(jīng)人鼠劑量換算，按比例稱取各藥，煎熬濃縮至每毫升水煎液含1.785g生藥。西藥組予以去氧孕烯炔雌醇片，用蒸餾水配成0.002%的溶液。各組每日均按0..01mL/1g灌胃。給藥15天。

2.3 取材與檢測(cè)

末次給藥24h后，處死大鼠，迅速摘取卵巢，剝除周圍脂肪組織后浸泡于10%甲醛溶液中固定24h以上，常規(guī)石蠟包埋。采用免疫組織化學(xué)SP方法，測(cè)定凋亡基因Caspase-3、Fas、Caspase-12、CytC在卵巢的表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色采用SP法，Caspase-3、Fas—抗工作濃度1∶200，Caspase-12、CytC—抗工作濃度1∶400，抗原修復(fù)采用EDTA微波修復(fù)。用顯微鏡及顯微圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化染色后的切片進(jìn)行數(shù)碼照相及圖像分析。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

3 結(jié) 果

3.1 益腎續(xù)經(jīng)湯對(duì)卵巢Fas蛋白表達(dá)的影響見表1。

表1 各組大鼠卵巢Fas表達(dá)水平比較 （±s）

表1 各組大鼠卵巢Fas表達(dá)水平比較 （±s）

注：與青年組比較，★P<0.05；★★P<0.01；與MT早期模型組比較，◆◆P<0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)（n）Fas表達(dá)（IOD）青年組 8 60.28±1.66 MT早期模型組 8 101.39±2.13★★MT晚期模型組 8 128.48±3.69◆◆MT早期治療組 8 68.19±9.39◆◆★MT晚期治療組 8 125.74±3.70△西藥對(duì)照組 8 100.09±1.99◇

3.2 益腎續(xù)經(jīng)湯對(duì)卵巢CytC、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響見表2。

表2 各組大鼠卵巢CytC、Caspase-3表達(dá)水平比較 （±s）

表2 各組大鼠卵巢CytC、Caspase-3表達(dá)水平比較 （±s）

注：與青年組比較，★★P<0.01；與MT早期模型組比較，◆P<0.05；◆◆P<0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)（n）CytC表達(dá)（IOD）Caspase-3表達(dá)（IOD）青年組 8 148.51±3.32 99.88±4.58 MT早期模型組 8 178.08±4.30★★ 120.13±9.95★★MT晚期模型組 8 358.99±16.17◆◆ 140.18±3.64◆◆MT早期治療組 8 158.20±9.06◆◆★★ 110.61±6.41◆★★MT晚期治療組 8 351.55±15.97 137.24±4.12西藥對(duì)照組 8 173.13±7.08◇ 117.73±7.77

3.3 益腎續(xù)經(jīng)湯對(duì)卵巢Caspase-12蛋白表達(dá)的影響見表3。

表3 各組大鼠卵巢Caspase-12表達(dá)水平比較 （±s）

表3 各組大鼠卵巢Caspase-12表達(dá)水平比較 （±s）

注：與青年組比較，★P<0.05；與MT早期模型組比較，◆P<0.05，▲▲P<0.01。與MT晚期模型組比較，▲P<0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)（n）Caspase-12表達(dá)（IOD）青年組 8 165.65±3.16 MT早期模型組 8 172.83±7.53★MT晚期模型組 8 330.88±28.97◆◆MT早期治療組 8 167.58±3.05◆MT晚期治療組 8 293.75±37.33▲西藥對(duì)照組 8 170.99±7.46

3.4 卵巢Caspase-3表達(dá)與Fas、Caspase-12、CytC表達(dá)水平的相關(guān)性。

未給藥組大鼠卵巢Caspase-3表達(dá)與其他凋亡指標(biāo)的兩因素相關(guān)分析顯示，Caspase-3與Fas (r=0. 453，P<0.001)、Caspase-12 (r=0.798，P<0.001)和 CytC (r=0.935，P<0.001)均呈顯著正相關(guān)。

4 討 論

Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶家族，這些蛋白酶是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶。細(xì)胞凋亡的途徑主要有內(nèi)源性途徑（又稱為線粒體途徑）、外源性途徑（又稱為死亡受體途徑、細(xì)胞外通路、細(xì)胞膜途徑）以及近年來發(fā)現(xiàn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ER通路。在內(nèi)源性途徑中，線粒體扮演了重要的角色，其不僅是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細(xì)胞凋亡調(diào)控中心和細(xì)胞生命活動(dòng)控制中心。外源性途徑，一是Fas/FasL信號(hào)途徑，由Fas與FasL結(jié)合，從而啟動(dòng)凋亡信號(hào)。二是TNFR-1信號(hào)途徑。TNF與TNFR-1結(jié)合 ,下傳凋亡信號(hào)，活化Caspase-8，然后激活下游的Caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［1，2］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑是由Caspase-12啟動(dòng)Caspase的第3條途徑，即主要是由于細(xì)胞在某些因素作用下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔未折疊蛋白增多和鈣失調(diào)，可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和Caspase-12活化［3］，激活的Caspase-12移位至細(xì)胞質(zhì)與激活的Caspase-9結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)［4］。3種途徑最后匯聚到同一通路，即活化的Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12等均激活 Caspase-3，最終致細(xì)胞凋亡［5］。細(xì)胞凋亡專指經(jīng)典細(xì)胞凋亡，又稱為Caspase依賴型凋亡途徑。

益腎續(xù)經(jīng)湯是我們治療絕經(jīng)過渡期早期月經(jīng)后期及月經(jīng)量少的經(jīng)驗(yàn)方，針對(duì)女性衰老早期肝血不足的特殊生理病理特點(diǎn)，以養(yǎng)肝血、補(bǔ)腎精、通血脈立論擬定。方中何首烏性溫而不燥，藥性緩和，可養(yǎng)血益肝，固精益腎；肉蓯蓉補(bǔ)腎陽而不燥，與何首烏一同補(bǔ)益肝腎、養(yǎng)血填精，共為君藥。熟地質(zhì)地柔潤(rùn)，溫而不燥，有補(bǔ)血滋陰、生精補(bǔ)髓之效；雞血藤養(yǎng)肝血、祛瘀滯以通絡(luò)；當(dāng)歸味甘而補(bǔ)血，氣輕而辛以活血，三藥協(xié)助君藥補(bǔ)腎養(yǎng)肝、活血補(bǔ)血，共為臣藥。黃芪補(bǔ)氣以助血之速生，丹皮涼血祛瘀，防諸溫藥傷津，二者共為佐藥。牛膝獨(dú)理肝腎二經(jīng)，為使藥。諸藥配伍，共達(dá)養(yǎng)肝血、補(bǔ)腎精、通血脈之效。研究提示，益腎續(xù)經(jīng)湯對(duì)絕經(jīng)過渡期卵巢細(xì)胞凋亡的抑制作用是通過降低3條經(jīng)典凋亡途徑的啟動(dòng)凋亡因子Fas、CytC、Caspase-12的表達(dá)，從多靶點(diǎn)降低凋亡啟始酶的活化或釋放，抑制3條Caspase依賴型鏈?zhǔn)降鞍酌讣?jí)聯(lián)反應(yīng)，繼而降低卵巢Caspase-3蛋白的表達(dá)，阻止卵巢Caspase依賴型凋亡通路，延緩卵巢老化進(jìn)程。

［1］Gross A，McDonnell JM，Korsmeyer SJ.BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis［J］.Genes Dev，1999，13（15）:1899-1911.

［2］Burlacu A. Regulation of apoptosis by Bcl-2 family proteins［J］.J Cell Mol Med，2003，7（3）:249-257.

［3］張琳剛，張?zhí)煊?，譚寧.細(xì)胞程序性死亡的非Caspase依賴型途徑［J］. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，9（19）:3760.

［4］李天富，羅玉敏，呂傳真.細(xì)胞凋亡與Caspase機(jī)制的調(diào)控［J］.中國(guó)臨床神經(jīng)病學(xué)，2003，11（3）:314.

［5］Dasmahapatra G，Almenara SG，etal. Flavopiridol and Histone Deacetylase Inhibitors Promote Mitochondrial Injury and Cell Death in Human Leukemia Cells That Over express Bcl-2［J］.MolPharmacol，2006，69:288-289.