閔婭蘭,程年群,田 虹,劉愛(ài)東,劉曉紅,肖 智,曾俊偉

(遵義醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室暨貴州省麻醉與器官功能保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

P2Y受體激動(dòng)劑2-mesADP誘發(fā)脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i升高

閔婭蘭,程年群,田 虹,劉愛(ài)東,劉曉紅,肖 智,曾俊偉

(遵義醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室暨貴州省麻醉與器官功能保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

目的觀察體外培養(yǎng)的背角小膠質(zhì)細(xì)胞P2Y受體激活對(duì)其[Ca2+]i的影響。方法培養(yǎng)并純化脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞，采用激光共聚焦技術(shù)觀察P2Y受體激活后小膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i 的變化。結(jié)果P2Y 受體激動(dòng)劑2-mesADP在10 μm即可引起小膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i升高，當(dāng)隨著2-mesADP濃度增大，小膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i升高更為明顯。結(jié)論體外培養(yǎng)的大鼠脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞 P2Y受體激活可以促進(jìn)細(xì)胞[Ca2+]i 升高。

脊髓背角; 小膠質(zhì)細(xì)胞; P2Y受體

近年研究表明，脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。鞘內(nèi)注射選擇性的小膠質(zhì)細(xì)胞活性抑制劑米諾環(huán)素可以緩解坐骨神經(jīng)炎性痛、關(guān)節(jié)炎性痛、坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷及L5 脊神經(jīng)切斷等模型大鼠的痛覺(jué)過(guò)敏癥狀[1-3]。但最近通過(guò)形態(tài)學(xué)方法觀察到P2Y6mRNA,P2Y12mRNA,P2Y13mRNA,P2Y14mRNA受體存在于脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞[4]。鞘內(nèi)注射P2Y6受體拮抗劑MRS2578、P2Y12受體拮抗劑MRS2395、P2Y13受體拮抗劑MRS2211和P2Y14受體反義核酸均可以緩解大鼠神經(jīng)病理性疼痛[4-5]，但其具體機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)采用離體培養(yǎng)脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞，觀察P2Y 受體激動(dòng)劑2-mesADP是否可以通過(guò)影響小膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SD 乳鼠由遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主要試劑: DMEM/F12、DMEM高糖培養(yǎng)基及胎牛血清均為Hyclone 產(chǎn)品；OX-42抗體購(gòu)自Abcam；抗體稀釋液、山羊免疫組化試劑盒及DAB試劑盒均來(lái)自北京中山金橋公司；Fluo-4/ AM及F-127購(gòu)自Dojindo；2-mesADP購(gòu)自Sigma。主要儀器：激光掃描共聚焦顯微鏡，德國(guó)LeicaTCS2TN 型。

1.2 背角小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 SD 乳鼠(lt;3 d)，乙醚麻醉,750 mL/L 乙醇消毒，,解剖顯微鏡下取出脊髓背角組織，1.25 mg/mL胰蛋白酶37 ℃消化20～30 min，加入含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打成細(xì)胞懸液，,接種于75 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)10 d 后細(xì)胞鋪滿瓶底，置于180 r/min，37 ℃搖床2 h，得到高純度小膠質(zhì)細(xì)胞。接種在蓋玻片上培養(yǎng)72 h后，4%多聚甲醛固定15 min，0.01 m PBS漂洗，加入小鼠源OX-42單克隆抗體(1∶500) ，37 ℃1 h ，4 ℃過(guò)夜后取出，加入山羊二抗，37 ℃1 h，0.01m PBS中漂洗，5 min×3次；即用型DAB顯色，及時(shí)終止反應(yīng)。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察ox-42陽(yáng)性細(xì)胞為小膠質(zhì)細(xì)胞。

1.3 激光共聚焦技術(shù)觀察小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+] i濃度變化 將小膠質(zhì)細(xì)胞接種于蓋玻片上,隨機(jī)分為5組：加入: ①2-mesADP (0.01 μm)；②2-mesADP (0.1 μm)；③2-mesADP(1 μm) ；④2-mesADP(10 μm)；⑤2-mesADP (100 μm)。以未加藥時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度為對(duì)照。各組細(xì)胞以Fluo-4/ AM (2 μm)熒光指示劑負(fù)載，37 ℃避光孵育30 min 后用DMEM高糖培養(yǎng)基漂洗3 遍，以少許DMEM高糖培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞，避光待測(cè)。掃描技術(shù)參數(shù)為：激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)515 nm，分別加入上述藥物,檢測(cè)10 min，得到加藥后鈣熒光圖像并存入計(jì)算機(jī)中，Ca2 +熒光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)變化反映胞內(nèi)游離Ca2 +濃度的變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有計(jì)量資料均以表示，采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。兩組間差異顯著性檢驗(yàn)采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間顯著性比較用ANOVA分析，以Plt;0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)的大鼠背角小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置相差顯微鏡下見(jiàn)原代培養(yǎng)的背角小膠質(zhì)細(xì)胞，胞體較大，可見(jiàn)多個(gè)長(zhǎng)短不一的纖細(xì)突起，呈蜘蛛樣。OX-42陽(yáng)性細(xì)胞為小膠質(zhì)細(xì)胞，用免疫化學(xué)方法鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞中OX-42免疫反應(yīng)陽(yáng)性率gt;90%，表明培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞符合實(shí)驗(yàn)要求。

注：A：混合培養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞 B：純化的小膠質(zhì)細(xì)胞OX-42表達(dá)。 圖1 小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)觀察

2.2 2-mesADP對(duì)背角小膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i 的影響 與靜息狀態(tài)下小膠質(zhì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度值相比，0.01 μm 2-mesADP可以誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞Ca2+熒光強(qiáng)度輕度升高，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；0.1～100 μm 2-mesADP可以以劑量依賴(lài)的方式誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞Ca2+熒光強(qiáng)度逐步升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.001)； 100 μm 2-mesADP誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i 明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.001)。

注：***P﹤0.001，與對(duì)照組比較。 圖2 2-mesADP(0.1～100 μm)促進(jìn)背角小膠質(zhì)細(xì)胞Ca2+ 熒光強(qiáng)度升高

3 討論

近來(lái)大量研究證明,多種P2Y6受體mRNA,P2Y12受體mRNA,P2Y13mRNA,P2Y14受體mRNA存在于脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞，但目前對(duì)于P2Y受體如何影響小膠質(zhì)細(xì)胞生理功能目前并清楚。P2Y6受體與配體結(jié)合后激活Gq蛋白，進(jìn)而激活磷脂酶C，催化底物磷脂酰肌醇- 4，5-二磷酸(PIP2)水解生成三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DAG)，IP3動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)Ca2+，產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)[6]。P2Y12受體、P2Y13受體和P2Y14受體可以激活Gi 蛋白，抑制cAMP的產(chǎn)生[7]。但是Lee 和 Chung 也觀察到 ADP激活 P2Y12受體的瞬間細(xì)胞內(nèi)cAMP水平上調(diào)并伴有PKA的激活；另外，P2Y12受體激活后也可以通過(guò)磷脂酶C途徑引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度上升，促進(jìn)PKB磷酸化[8]。在本實(shí)驗(yàn)觀察到，培養(yǎng)的背角小膠質(zhì)細(xì)胞，P2Y受體激動(dòng)劑2-mesADP可以誘發(fā)背角小膠質(zhì)細(xì)胞劑量依賴(lài)性 [Ca2+]i升高，但這種[Ca2+]i升高是源于何種機(jī)制，尚有待進(jìn)一步探討。在小膠質(zhì)細(xì)胞，[Ca2+]i升高有助于促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活化和一些神經(jīng)活性物質(zhì)的釋放，進(jìn)而影響小膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元突觸傳遞。這有可能是P2Y受體參與脊髓平面痛覺(jué)中樞敏感化的機(jī)制之一。

[1] Tozaki-Saitoh H,Tsuda M,Miyata H,et al.P2Y12 receptors in spinal microglia are required for neuropathic pain after peripheral nerve injury[J].J Neurosci,2008,28:4949-4956.

[2]Cattaneo M.The P2 receptors and congenital platelet function defects[J].Semin Thromb Hemost,2005,31:168-173.

[3]Costanzi S,Mamedova L,Gao Z G,et al.Architecture of P2Y nucleotide receptors: structural comparison based on sequence analysis,mutagenesis,and homology modeling[J].J Med Chem,2004,47:5393-5404.

[4]Kobayashi K,Yamanaka H,Yanamoto F,et al.Multiple P2Y subtypes in spinal microglia are involved in neuropathic pain after peripheral nerve injury[J].Glia,2012,60(10):1529-1539.

[5]閔婭蘭,劉曉紅,肖智,等.鞘內(nèi)注射MRS2395對(duì)慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠脊髓背角Iba1表達(dá)的影響[J].臨床麻醉學(xué)雜志，2012,28(11): 81-84.

[6]Tatur S,Groulx N,Orlov S N,et al.Ca2+-dependent ATP release from A549 cells involves synergistic autocrine stimulation by coreleased uridine nucleotides[J].J Physiol,2007,584(Pt 2): 419-435.

[7]Lee S,Chung C Y.Role of VASP phosphorylation for the regulation of microglia chemotaxis via the regulation of focal adhesion formation/maturation[J].Mol Cell Neurosci,2009,42: 382-390.

[8]Irino Y,Nakamura Y,Inoue K,et al.Akt activation is involved in P2Y12receptor-mediated chemotaxis of microglia[J].J Neurosci Res,2008,86:1511-1519.

[收稿2012-11-12;修回2012-12-12]

(編輯：譚秀榮)

P2Yreceptoragonistinducedtheincreaseof[Ca2+]iincultureddorsalhornmicroglialcells

Minyalan,Chengnianqun,Tianhong,Liuaidong,Liuxiaohong,Xiaozhi,Zengjunwei

(Department of Physiology,Zunyi Medical University; Guizhuou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo investigate the effect of 2-mesADP (P2Y receptor agonist) on the change of [Ca2+]i in dorsal horn microglial cells.MethodsThe expression of ox-42 in cultured dorsal horn microglial cells was observed by immunohistochemical staining.2-mesADP-induced Ca2+mobilization in cultured dorsal horn microglia was measured by laser scanning confocal microscopy.ResultsCultured dorsal horn microglial cells expressed high level of ox-42.Furthermore,2-mesADP could induce the increase of the Ca2+fluorescent intensity in microglial cells in a dose-dependent manner.ConclusionP2Y receptor agonists 2-mesADP can induce the increase of [Ca2+]i in dorsal horn microglial cells.

Dorsal horn; microglial cell; P2Y receptor

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO:31000497);遵義醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(NO：2009)。

曾俊偉,女，副教授，研究方向：疼痛生物學(xué)機(jī)制，E-mail:junweizeng@sohu.com。

R744.5

A

1000-2715(2013)01-0010-03