游 露，陳 松，王 勇，李姍姍，竇雪嬌，張 紅

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義563099)

體外循環(huán)犬單肺缺血再灌注損傷模型的建立

游 露，陳 松，王 勇，李姍姍，竇雪嬌，張 紅

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義563099)

目的建立體外循環(huán)單肺缺血再灌注損傷動物模型。方法6只健康雜種犬阻斷左肺動脈，終止左肺血供及通氣，造成左肺缺血，并循體外循環(huán)60 min后開放左肺動脈，恢復左肺血供及通氣形成再灌注損傷，左肺再灌注2.5 h后結束實驗，右肺全程維持血供及通氣。于CPB前(T1)、阻斷左肺動脈并循60 min(T2)、再灌注2.5 h(T3)三個時間點觀察肺組織病理學變化并進行評分，對比肺動態(tài)順應性(CD)、氧和指數(shù)(OI)、呼吸指數(shù)(RI)變化比例。結果①病理學變化：CPB后左、右肺組織見大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔增寬，肺泡壁斷裂甚至壞死；左肺病理改變較右肺嚴重；②病理切片評分：CPB后左、右肺病理評分逐漸升高；T1時點左、右肺組織評分無差異，T2、T3時點左肺評分明顯高于右肺；③CD、OI、RI變化比例：CPB后CD、OI明顯下降，RI明顯升高；左肺CD、OI下降程度、RI升高程度較右肺明顯。結論本實驗動物模型建立成功，能全面地模擬臨床心臟手術過程，對CPB肺保護相關研究有著積極的推動作用。

體外循環(huán)；單肺缺血再灌注損傷；動物模型；犬

肺保護一直是體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass，CPB)心臟外科手術研究的熱點，臨床研究的風險性較高，多數(shù)研究的實施依賴于動物模型。因此，簡單、易行的動物模型對CPB肺保護的研究有著重要的意義。傳統(tǒng)的心臟停跳模型[1-2]，因心臟停跳往往對動物損傷較大，多數(shù)動物(尤其是小動物)不能耐受，影響實驗的進一步實施，遠期肺損傷得不到研究；心臟不停跳模型[3-4]，雖然提高了動物的耐受性，但僅能模擬體外非生理循環(huán)狀態(tài)，不能體現(xiàn)缺血再灌注損傷。為此，本實驗的目的是建立既能模擬體外心臟手術過程又能提高動物耐受性，在心臟不停跳的基礎上建立單肺(左肺)缺血再灌注損傷模型，為體外循環(huán)肺保護提供新的研究手段。

1 材料與方法

1.1 實驗準備 健康成年雜種犬6只，體重10～15 kg，雌雄不拘，由遵義醫(yī)學院動物實驗中心提供。動物用2.5%戊巴比妥25 mg/kg，腹腔內(nèi)注射麻醉，仰臥位固定于手術臺，行雙腔氣管插管(根據(jù)需要實施單側通氣)，監(jiān)護ECG、測舌粘膜氧飽和度(SmO2)等，分別于右側股動、靜脈置管監(jiān)測動態(tài)平均動脈壓(MAP)及中心靜脈壓(CVP)，測量直腸溫度，術中間斷給予戊巴比妥鈉維持麻醉。用羥乙基淀粉300 mL及乳酸鈉林格氏液100 mL充CPB管道，排氣后備用。

1.2 手術操作 開胸前，給肌松藥，調(diào)節(jié)呼吸機潮氣量12～15 mL/kg，呼吸頻率16次/min，I:E=1:2，F(xiàn)iO2=99%，接麻醉機行機械通氣。正中劈開胸骨，操作時避開大血管，進入胸腔后切開心包暴露心臟；游離左側肺動脈及右側肺動脈，分離右側動脈時，由于犬的右肺動脈位置較深，需要將心臟整個翻起，操作時盡量輕柔、快速，避免損傷，若出現(xiàn)循環(huán)不穩(wěn)定，停止操作，待犬循環(huán)穩(wěn)定后進行下一步操作。右心房內(nèi)注入肝素3 mg/kg，肝素化后分別行升主動脈和右心房插管，連接人工心肺機及CPB管道；待ACT>480 s后開始CPB開始轉流，阻斷左肺動脈，調(diào)整雙腔氣管導管行右側單肺通氣(以直視左側肺部完全塌陷，右肺單肺通氣為標準)，并行循環(huán)60 min后開放左肺動脈，恢復左肺血液灌注及機械通氣，30 min內(nèi)逐漸停止CPB，停機時用魚精蛋白(1∶1.5)中和肝素，機血回收后回輸入犬體內(nèi)，再灌注2.5 h后實驗結束。術中根據(jù)情況適當應用腎上腺素或硝普鈉股靜脈泵入，維持循環(huán)的穩(wěn)定。在此過程中，通過動脈血氣分析來調(diào)整酸堿及電解質(zhì)平衡。實驗犬均采用淺低溫CPB，維持MAP在60～80 mmHg，CVP在5～12 cmH2O，灌注流量在100～120 mL/kg/min。

1.3 標本采集及指標檢測

1.3.1 病理學變化 分別于CPB前(T1)、阻斷左肺動脈并循60 min(T2)、再灌注2.5 h后(T3)各時點取左、右肺組織，T1時點取上葉肺尖，T2時點取中葉肺尖，T3時點取下葉肺尖，約為1 cm×1 cm，用10%福爾馬林固定，石蠟切片(5 μm)，HE染色，光鏡下觀察肺組織病理變化。

1.3.2 病理切片評分 根據(jù)改良的Mayer等[5-6]標準進行病理評分，每張病理切片隨機選擇3個高倍鏡視野分別進行評分，取平均值作為此切片的評分。

1.3.3 肺功能變化比例 于體外循環(huán)轉機前，短暫阻斷一側肺動脈，并調(diào)整潮氣量行對側單肺通氣，使循環(huán)血流及機械通氣量完全通過單側肺動脈及支氣管，分別獲得左、右肺功能指標的基礎值：①肺動態(tài)肺順應性(pulmonary dynamic compliance，CD)，CD= V/P，V=潮氣量，P=氣道峰壓-呼氣末正壓，測量時動物充分鎮(zhèn)靜；②氧合指數(shù)(oxygenation index，OI)，OI=PaO2/ FiO2。T1、T3時點取股動脈血1 mL，行動脈血氣分析(T2時點左肺無血供及通氣，故無血氣分析)檢測血氧分壓(PaO2)，PaO2與吸入氧濃度(FiO2)之比即為血氧和指數(shù)；③呼吸指數(shù)(respiration index，RI) ，RI=P(A-a)O2/ PaO2，P(A-a)O2(肺泡-動脈血氧分壓差)= (Pa-PH2O)FiO2-PaO2-PaCO2，P為大氣壓，標準狀態(tài)下為760 mmHg，PH2O為飽和水蒸氣壓，標準狀態(tài)下為47 mmHg，F(xiàn)iO2(%)為99%的吸入氧濃度。

左肺再灌注2.5 h后，根據(jù)上述方法，分別測定左、右肺CD 、OI 、RI。計算相應左、右肺功能的變化比例= (再灌注后值-基礎值) /基礎值。

2 結果

2.1 一般資料 實驗動物體重、體表面積、前并循時間、左肺動脈阻斷時間、后并循時間、CPB時間、灌注液體積以及最低鼻咽溫等比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 肺組織病理變化 T1時點各組肺組織結構清晰，肺組織結構正常。T2時點：右肺肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)少量水腫液及較多炎性細胞浸潤；左肺組織結構均紊亂，大量炎性細胞浸潤，肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)見大量水腫液(見圖1)。T3時點：右肺肺泡毛細血管擴張，肺間質(zhì)見大量水腫液及炎性細胞；左肺病理損傷較右肺嚴重，肺組織結構紊亂，肺間隔明顯增寬，肺間質(zhì)見大量水腫液，肺泡壁斷裂，肺泡腔塌陷，甚至可見部分肺泡壁壞死斷裂，紅細胞漏出(見圖3)。

注：A：右肺組織結構清晰，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)少量水腫液及炎性細胞浸潤；B：左肺組織結構紊亂，部分肺泡腔塌陷，肺泡內(nèi)及間質(zhì)出現(xiàn)水腫液及大量炎性細胞浸。 圖1 T2時點肺組織HE染色×400

注：C:右肺組織結構紊亂，肺泡腔塌陷，肺泡腔內(nèi)見大量滲出液及炎性細胞;D:左肺組織結構紊亂，大量肺泡腔塌陷，肺泡壁壞死斷裂，肺泡內(nèi)見大量水腫液和炎性細胞，紅細胞浸潤。 圖2 T3時刻肺組織HE染色×400

2.3 肺組織病理切片評分 CPB前左、右肺組織無明顯差異(P>0.05)；CPB后左、右肺各時點較CPB前評分逐漸升高(P<0.05)；T2、T3時點左肺病理評分明顯高于右肺(P<0.05，見表1)。

肺組織T1T2T3左肺0.24±0.073.73±0.30*6.03±0.22*#右肺0.21±0.073.27±0.24*△4.55±0.35*#△

注：與T1比較，*P<0.05 ；與T2比較，#P<0.05；與左肺比較，△P<0.05。

2.4 左、右肺肺功能的變化比例 利用血氣結果計算CD、OI 、RI及相應肺功能變化比例。再灌注2.5h后，左、右肺功能與基礎值比較均有不同程度的惡化。左肺CD、OI下降程度及RI增加程度比右肺明顯增加(P<0.05,見表2)。

肺組織CD減少比例OI減少比例RI增加比例左肺0.71±0.060.80±0.0516.53±7.74右肺0.43±0.02*0.66±0.07*7.33±5.10*

注:與左肺比較，*P<0.05。

3 討論

CPB期間血液成分與人工管道的接觸、中性粒細胞的釋放與聚集、內(nèi)毒素的釋放等均可引起機體復雜的炎癥反應，這種炎癥反應是引發(fā)全身系統(tǒng)性炎癥反應的重要原因；肺循環(huán)及呼吸機停止，使肺組織處于缺血、缺氧狀態(tài)，造成肺缺血性損害，肺組織細胞骨架及線粒體破壞嚴重；當開放肺動脈后，大量血液及氧氣進入肺循環(huán)造成肺再灌注損傷，導致肺功能嚴重下降[7-8]?？梢姡硐到y(tǒng)性炎癥反應及缺血再灌注損傷是導致CPB肺損傷的兩大主要因素。

根據(jù)體外循環(huán)肺損傷的特點建立CPB單肺(左肺)缺血再灌注損傷模型，在全程轉機的同時阻斷左肺動脈，模擬臨床心臟直視手術阻斷升主動脈心臟停跳過程中肺組織的缺血狀態(tài)；開放左肺動脈模擬CPB心臟復跳后肺組織再灌注損傷。與臨床實際操作不同，實驗動物心臟并不停跳，減少了動物的創(chuàng)傷，使實驗動物能夠長時間的保持循環(huán)穩(wěn)定(左肺再灌注后能維持生命體征平穩(wěn)超過2.5 h)。心臟不停跳的情況下全程并行循環(huán)，排出心臟因缺血再灌注對肺功能的干擾。在既有的CPB單肺肺損傷模型[9]基礎上進行改良，簡化了分離左肺靜脈，減少了操作步驟，更簡單易行，提高了實驗的成功率。為了平衡左、右肺的差異，分別測量左、右肺基礎值(選擇體外循環(huán)建管之后，轉流之前的測量值為肺功能基礎值)，通過對比再灌注后2.5 h左、右肺功能的變化的比例，來代替實測值判斷雙側肺功能損傷的程度。

實驗結果顯示：CPB前左、右肺組織結構清晰，肺泡間隔無明顯增寬，肺泡腔未見填充物；CPB后左、右肺組織損傷逐漸加重，出現(xiàn)肺泡間隔增寬，大量炎性細胞浸潤，肺泡腔內(nèi)及肺間質(zhì)見大量水腫液；同時肺組織病理切片評分也逐漸升高；再灌注2.5 h后，左肺較右肺肺組織損傷更嚴重；左肺比右肺同時點病理評分明顯增高(P<0.05)。說明：CPB可導致肺組織結構的病理改變；左肺由于遭受全身炎癥反應與缺血再灌注的雙重打擊，與右肺比較，左肺損傷更嚴重。提示，左肺缺血再灌注損傷建立成功。

CD、OI、RI是公認的反應肺功能的指標[10]，通過對比CD、OI、RI肺功能變化比例來判斷肺功能損傷的程度。本實驗結果：與基礎值相比左、右肺功能均有不同程度的惡化；與右肺比較，左肺CD、OI、RI的惡化程度均明顯增加(P<0.05)，左肺肺損傷程度明顯重于右肺。說明：左肺在非生理性循環(huán)的基礎上，又遭受了缺血再灌注損傷，使肺功能進一步惡化。

綜上所述，CPB單肺缺血再灌注損傷模型建立成功，實驗犬左肺能夠同時反映CPB非生理循環(huán)及缺血再灌注的雙重打擊，充分模擬臨床心臟手術過程。本模型適用于體外循環(huán)肺損傷及其機制的實驗研究，有助于體外循環(huán)肺保護的發(fā)展。

[1] 蔣祖明,李瑋浩,俞曉青,等.乳豬深低溫停循環(huán)對肺保護作用的觀察[J].中國體外循環(huán)雜志,2009,7(4):238-240, 249.

[2]高光潔,宋丹丹,張鐵錚.大鼠開胸停跳體外循環(huán)模型的建立[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學,2011,38(11):2117-2119.

[3]朱搖賢,吉冰洋,劉晉萍,等.新型無血預充大鼠體外循環(huán)模型的建立[J].中國體外循環(huán)雜志,2012,10(3):171-174.

[4]Lebreton G, Tamion F, Bessou J P, et al. Cardiopulmonary bypass model in the rat: a new minimal invasive model with a low flow volume[J]. Interact Cardiovasc Thorac Surg,2012,14(5):642-644.

[5]Mayer J,Laine V J,Rau B,et al.Systemic lymphocyte activation modulates the severity of diet-induced acute pancreatitis in mice[J].Pancreas,1999,19(1):62-68.

[6]Osman M O,Kristensen J U,Jacobsen N O,et al.A monoclonal anti-interleukin 8 antibody(WS-4) inhibits cytokine response and acute necrotising pancreatitis in rabbits[J].Gut,1998,43(2):232-239.

[7]Kats S, Sch?nberger J P, Brands R, et al. Endotoxin release in cardiac surgery with cardiopulmonary bypass: pathophysiology and possible therapeutic strategies. An update[J]. Eur J Cardiothorac Surg,2011,39(4):451-458.

[8]Hengst W A, Gielis J F, Lin J Y,et al. Lung ischemia-reperfusion injury:a molecular and clinical view on a complex pathophysiological process [J]. Heart and Circulatory Physiology,2010, 299(5): 1283-1299.

[9]張仁騰,汪曾煒,王輝山,等.體外循環(huán)肺損傷動物模型的建立[J].中國體外循環(huán)雜志,2011,2(9):105-108.

[10]崔虎軍,張明禮,肖鋒,等.體外循環(huán)術后肺功能指標的比較及相關性分析[J].北京大學學報,2003,35(2):195-199.

Establishmentofdoglungischemia-reperfusioninjuryofcardiopulmonarybypassmodel

Youlu,Chensong,Wangyong,Lishanshan,Douxuejiao,Zhanghong

(Department of Anesthesiology,The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo establish a single lung ischemia-reperfusion injury of cardiopulmonary bypass (CPB) animal model in dog.MethodsSix healthy mongrel dogs was established the CPB mode, at the same time, the left pulmonary artery was clamping on; termination of the left lung blood supply and ventilation cause left lung ischemia,and left pulmonary artery was opened at 60 minutes. Restore left lung blood supply and ventilation formed reperfusion injury. The experiment was finished after reperfusion 2.5 h. Before CPB (T1), blocking the left pulmonary artery and through 60 min (T2), reperfusion 2.5 h (T3) three time points pathological changes of lung tissue and score Compare with left and right lung function change of pulmonary dynamic compliance (CD), and oxygen index (OI), respiratory index (RI) after reperfusion 2.5 h.Results①After CPB,left and right lung pathological structures was deteriorated to varying degrees; the left lung tissue structural disorder , alveolar wall rupture and necrosis , inflammatory cells and red blood cell was leakage , pathological damage was severe than the right lung after reperfusion 2.5 h.②Pathological section score of lung tissue: After CPB , compared with CPB before the scores gradually increased at each time point; the left lung score was significantly higher than the right lung in reperfusion 2.5 h.③The deterioration of the left lung of CD,OI,RI was significantly increased than the rigt lung after reperfusion 2.5h.ConclusionThe experimental animal model was successfully established, and comprehensively simulate lung injury factors in the process of clinical cardiopulmonary bypass . CPB lung protection related research was promoted.

Cardiopulmonary bypass; ischemia-reperfusion injury of lung; animal model; dog

貴州省科技廳聯(lián)合基金資金資助(NO:黔科合J字LKZ[2012]05)。

張紅,女,教授,碩士生導師,研究方向:體外循環(huán)肺保護，E-mail:hianzhang@tom.com。

R332

A

1000-2715(2013)05-0437-04

[收稿2013-05-21;修回2013-09-13]

(編輯：譚秀榮)