(中國科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 北京100049)

1 引 言

當前，食品安全問題日益突出，在眾多食品污染物中，“瘦肉精”倍受關(guān)注?！笆萑饩狈褐改芙档椭尽⑻岣呤萑饴实囊活愃幬?，通常屬于β-興奮劑(β-Agonists)，又叫β-激動劑或β-受體激動劑，全稱β-腎上腺素能興奮劑(β-Adrenergic Agonist)?？藗愄亓_(又稱克喘素、雙氯醇胺或苯甲醇胺)、萊克多巴胺、沙丁胺醇(又稱舒喘寧)、西馬特羅(又稱息喘寧)、特布他林是5種最常見的“瘦肉精”(見表1)。

“瘦肉精”可提高家禽和牲畜肌肉的生成速度[1]，用于促生長目的時劑量一般都超過 5 μg/g，當添加到飼料中的藥量超過此劑量時，就達到“同化劑量”。該類藥物易在畜禽體內(nèi)尤其是肝臟組織中蓄積，當人體中累計攝入劑量超過一定值或一次食入高殘留量(>0.1 μg/g)的內(nèi)臟組織如肝、腎、肺時，易導(dǎo)致β-興奮劑毒副作用，出現(xiàn)頭暈、心悸、手指震顫等中毒癥狀，此類藥物造成的威脅已成為重大的食品安全問題。許多國家和地區(qū)都明令禁止在畜牧業(yè)中使用“瘦肉精”，以保證消費者的權(quán)利和安全。在我國，禁止使用任何類型“瘦肉精”。又因該類藥物用于人體可以降低體重和增加骨骼肌肉力量[2]，加之其促蛋白同化作用及可以興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)，被非法用于體育運動中，已被世界反興奮劑機構(gòu)(WADA)列為禁藥。

1.1 鹽酸克倫特羅

“瘦肉精”中影響最廣的是鹽酸克倫特羅 (Clenbuterol, CLB)，又稱“克侖特羅”，化學(xué)名為“2-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3,5二氯苯甲醇鹽酸鹽”，可舒張支氣管、改善通氣、舒張和松弛子宮平滑肌。最初主要用于人類哮喘和動物肺部疾病，又稱氨哮素、雙氯醇胺，還具有抗炎和神經(jīng)營養(yǎng)性作用以及誘導(dǎo)神經(jīng)保護作用[3]。因偶然發(fā)現(xiàn)其具有促進蛋白同化作用，且比合成代謝類固醇藥物有更高的選擇性，可減少脂肪的形成，提高瘦肉和脂肪的比率，而在畜禽生產(chǎn)中曾被用作“營養(yǎng)再分配劑”及“促生長劑”，克倫特羅也是至今最有效和應(yīng)用最廣的“再分配劑”。

表1 5種常見“瘦肉精”的基本信息

1.2 萊克多巴胺

萊克多巴胺(RAC，商品名培林)也屬常見的“瘦肉精”。1999年底，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準其作為豬飼料添加劑。它毒性低、代謝快、較少蓄積，更安全高效。如今，美洲和亞洲的20多個國家允許其使用，但規(guī)定豬肉上市前，殘余量須低于50 ppb(相當于每kg豬肉中含50μg)，以免造成中毒。還有國家或機構(gòu)允許其使用，但殘余量允許范圍更低。

聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織的食品添加劑聯(lián)合專家委員會(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, JECFA)及其它國家根據(jù)自己國民飲食的習(xí)慣等制定了自己牛肉和豬肉的最高殘留允許量(Maximum Residue Limits, MRL)標準(見表2)。

表2 萊克多巴胺在各國的最大殘留容許量標準 單位：μg/kg

1.3 檢測方法

生物樣品中β-興奮劑殘留量的檢測具有重要意義，不僅可以用于藥物代謝動力學(xué)的研究，還可以為飼養(yǎng)業(yè)及體育運動中濫用β-興奮劑提供證據(jù)。但因其在生物樣品中的含量很低，檢測限要達到ng/mL的水平，這對樣品的前處理提出了很高的要求，檢測也具有一定的難度。

目前已經(jīng)開發(fā)了一些方法用于分析“瘦肉精”，主要是氣相色譜法(GC)與高效液相色譜(HPLC)法，所用檢測器主要為質(zhì)譜(MS)檢測器和紫外(UV)檢測器，少量為薄層色譜法(TLC)[4]和免疫分析(IA)法[5]。分析涉及的生物樣品有血、尿、肝臟及毛發(fā)等[6]。

標準檢測方法方面，國標及歐盟檢測多為質(zhì)譜法。我國衛(wèi)生部和國家標準化管理委員會制訂了多種β-興奮劑的檢測標準，如動物性食品樣品中的克倫特羅采用GC-MS定量分析，檢測限為0.5 μg/kg[7]；飼料中的沙丁胺醇、萊克多巴胺等多種β-興奮劑采用LC-MS進行定量分析，其檢測限均為10 μg/kg。我國現(xiàn)行部分相關(guān)標準中瘦肉精的檢測方法見表3。

表3 我國現(xiàn)行部分標準中β-興奮劑的檢測方法

續(xù)表1

目前市售快速檢測卡多為定性檢測?；谀z體金(硒)紙片的“瘦肉精”快速檢測卡應(yīng)用了競爭抑制免疫層析的原理，檢測對象主要是血液和尿液。該類試劑條、卡檢測結(jié)果的誤差很大，易使消費者產(chǎn)生誤解。

谷峰等[8]對β-興奮劑的檢測方法進行了綜述，認為酶聯(lián)免疫分析法是目前克倫特羅最佳殘留篩選檢測法，HPLC法、GC-MS和HPLC-MS法是檢測飼料及動物組織中克倫特羅殘留的最終確認方法。但是質(zhì)譜法等只在專業(yè)機構(gòu)進行，并且成本高，檢測過程長，不具備向普通市民推廣的基礎(chǔ)。

毛細管電泳法應(yīng)用于快速分離和測定“瘦肉精”在文獻中已有報道。毛細管電泳(Capillary Electrophoresis, CE)又稱高效毛細管電泳分析法(High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE)是一種功能強大的分離、分析方法，是分離科學(xué)中繼高效液相色譜(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)之后的又一重大進展，是近幾年來分析化學(xué)中發(fā)展最為迅速的領(lǐng)域之一。

毛細管電泳(CE)極具吸引力，具有諸多優(yōu)點：分離效率高(理論塔板數(shù)已達106～107/m)；分析時間短(一般在30min內(nèi)即可完成一次電泳操作)；消耗的溶劑或樣品體積??；重現(xiàn)性較好；成本低；方法開發(fā)比較容易、可以很方便地與質(zhì)譜等多種檢測手段集成[9-12]，可采用多種模式來改變選擇性，擴大應(yīng)用范圍；操作簡便，易于實現(xiàn)自動化；分離在水相介質(zhì)中進行，沒有或很少產(chǎn)生有機廢液，污染少，還可提供正交的，互補的分析。分析目標涵蓋無機離子、有機分子、對映體、生物大分子、細胞等，在分析化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、環(huán)境化學(xué)和醫(yī)藥等多個領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[13]。膠束毛細管電動色譜(MECC)是基于膠束增溶和電動遷移的新型液體色譜，在緩沖液中加入離子型表面活性劑形成膠束，溶質(zhì)分子在膠束相和水相分配存在差異從而可實現(xiàn)分離，這種模式拓寬了普通毛細管區(qū)帶電泳(CZE)的應(yīng)用范圍，改善了電泳分離的選擇性[14]，可用于中性物質(zhì)的分離或者區(qū)分手性化合物。

在檢測器選擇方面，電化學(xué)檢測器通常在樣品凈化處理較好時可以得到較高的靈敏度，但不穩(wěn)定，重現(xiàn)性差且不能作為梯度洗脫條件下的檢測器。質(zhì)譜檢測器尤其是二級質(zhì)譜則作為特異性檢測器，二級質(zhì)譜可以彌補色譜分離的不足，對樣品處理的要求也大大降低。質(zhì)譜檢測器靈敏度高，特異性好，但價格昂貴，儀器不普及[6]。UV檢測器價格便宜，最為普及，但其選擇性不佳，在分離效果不好時易受干擾，且靈敏度不高。二極管陣列檢測器(Diode array detector，DAD)，利用多元陣列檢測器進行多通道同時檢測多波長，在一定程度上可以彌補紫外固定波長檢測器選擇性不好的缺陷，自動掃描檢測器則有更大的優(yōu)越性：它既可提供色譜圖，又可提供光譜圖，能為化合物的鑒定提供定性資料。二極管陣列檢測器結(jié)構(gòu)較為簡單，運行可靠，性能優(yōu)良，是一類極有發(fā)展前景的分析儀器檢測器[15]，是具有很高光強度和需要最佳信噪比的應(yīng)用所選擇的檢測器。

二極管陣列檢測器在許多方面勝過其它檢測器，其主要特點有[15]：(1)掃描速度快，同時將機械驅(qū)動部分減少到最小限；(2)能采用比較光譜法確定峰純度；(3)可鑒定色譜峰；(4)可繪制三維色譜圖；(5)可提高選擇性；(6)適用于微柱分析。二極管陣列檢測器能高靈敏度地在極短時間內(nèi)對全波長范圍內(nèi)掃描，使波長測量更準確、可靠，得到的三維圖譜是傳統(tǒng)機械式波長掃描裝置無法做到的。目前，二極管陣列檢測器已成為分析化學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷、在線過程控制及工業(yè)在線檢測等光譜測量儀器重點選擇的關(guān)鍵部件之一。

不同化合物光譜特征各不相同，如果色譜峰是由均勻的同一種物質(zhì)產(chǎn)生，那么在色譜峰流出的各時間點，不同波長的比值為定值。圖1顯示同時檢測兩個波長(信號A和信號B)的色譜圖，Ratio A：B是兩個波長(A/B)的比值圖。純物質(zhì)的色譜圖比值恒定，顯示為一條直線，不純的比值圖是有明顯波動[16]。

A：不純物質(zhì)峰B：純物質(zhì)峰

圖1 鑒定峰純度的方法原理圖

段建平等[17]利用毛細管區(qū)帶電泳-紫外檢測方法可同時測定飼料中西馬特羅、鹽酸克倫特羅與沙丁胺醇。王偉宇等[18]使用小型化的毛細管電泳-電化學(xué)檢測技術(shù)測定豬尿和豬飼料中的克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇，在7 min內(nèi)可實現(xiàn)3種分析物的分離檢測。鄭妍鵬等[19]建立了可用于檢測豬內(nèi)臟中鹽酸克倫特羅含量的毛細管電泳電導(dǎo)檢測方法，采用醋酸/醋酸氨緩沖體系為運行電泳介質(zhì)，在最佳實驗條件下，鹽酸克倫特羅的線性范圍為1.2～20 μg/mL，檢測限為0.6 μg/mL。1997年文獻報道[20]采用毛細管電泳結(jié)合二極管陣列(DAD)檢測3種β-興奮劑，但是其實驗方法還有很大改進空間，其檢測結(jié)果與我們的結(jié)果也有明顯差異。

本研究最優(yōu)條件下可以在14 min之內(nèi)對檢測的5種“瘦肉精”進行分離檢測。樣品實際消耗少，將該法應(yīng)用于樣品的測定，快速、簡便、可靠。

2 實驗部分

2.1 儀器和試劑

P/ACE MDQ毛細管電泳儀(美國Beckman公司)，彈性無涂層石英毛細管柱，內(nèi)徑75 μm，長60.2 cm(有效分離長度為50 cm，美國Beckman公司)。純水機(PURELAB Classic, ELGA Lab Water, UK)，超聲波清洗機(天津市瑞普電子儀器公司)，pH計(丹佛儀器(北京)有限公司)，瑞士梅特勒電子天平(梅特勒-托利多(上海)有限公司)，高速離心機(美國Sigma公司)。

沙丁胺醇和克倫特羅購自中國藥品生物制品檢定所，萊克多巴胺、特布他林均購自德國(Dr. Ehrensterfer GmbH)，西馬特羅購于加拿大(Toronto Research Chemicals Inc.)，各標準品均按說明使用。模擬尿樣來自健康志愿者。

2.2 溶液的配制

制備0.l mol/L硼砂(Na2B4O7)、5 mol/L NaOH、1 mol/L HCl儲備液，取適量儲備液，精確調(diào)節(jié)pH值并加入SDS配成所需的運行緩沖液。用超純水配制5種β-興奮劑標準品均為1.0 mg/mL濃度的儲備液，低溫避光保存。其它不同濃度的系列標準品溶液用運行緩沖溶液稀釋得到。其它試劑均為分析純。

2.3 樣品的預(yù)處理

采集的尿液應(yīng)保存于4℃～8℃冰箱中，尿液應(yīng)經(jīng)離心處理，取上清液備用。進樣前為防止雜質(zhì)過多，可將樣品稀釋5倍，并以0.45 um聚丙烯濾膜過濾。

2.4 毛細管電泳檢測條件

按要求配制實驗所需各種緩沖溶液，試液與運行緩沖液均經(jīng)0.45 μm聚丙烯濾膜過濾，并經(jīng)10000 r/min高速離心脫氣5 min。每天電泳操作前毛細管均依次用甲醇-水(60：40)、0.1 mol/L NaOH、超純水及運行緩沖液沖洗5 min。每次進樣分析開始前, 均依次用0.1 mol/L NaOH，超純水和對應(yīng)的運行緩沖液沖洗5 min。分析過程中，樣品分析一次用運行緩沖液沖洗一次，連續(xù)電泳分離最多3次后及時更換運行緩沖液，盡量保證兩緩沖液瓶中緩沖液組分和高度一致，以保證分析的精度。本實驗采用壓力進樣，20psi(Pounds per square inch)×5s，正極進樣，負極柱上以二極管陣列(DAD)檢測器190～600nm檢測。

實驗在恒溫(25℃)、恒濕(相對濕度60%)的實驗條件下進行。

3 結(jié)果與討論

3.1 基本原理

由5種“瘦肉精”化學(xué)結(jié)構(gòu)式可以看出，其都含有苯環(huán)，而苯環(huán)上的共軛雙鍵會有紫外吸收，故可以采用紫外檢測器或二極管陣列(DAD)檢測器檢測。本實驗中采用二極管陣列檢測器在190到600 nm范圍內(nèi)全波長掃描其對光的吸收。對比發(fā)現(xiàn)，各種物質(zhì)在200 nm附近均有較強的吸收，故采用了200 nm下吸收峰面積進行定量。

影響毛細管電泳分析結(jié)果的因素主要包括毛細管的電滲流、進樣和信號采集、處理等。其中進樣方式優(yōu)化、毛細管預(yù)處理條件的選擇、電極電解作用的影響、溫度控制和后期的信號處理尤為重要[21]。

圖2為P/ACE MDQ毛細管電泳儀電泳圖界面。

圖 2 P/ACE MDQ毛細管電泳儀電泳圖界面(右上為固定時間點處不同波長下的吸收，右下為三維譜圖)

3.2 緩沖液的選擇

緩沖溶液的類型、濃度(離子強度)、pH 是毛細管電泳分離條件選擇的重要考慮因素，其會影響到電滲流、分離速度、分離選擇性、分離度。緩沖溶液的選擇一般無嚴格規(guī)律可循。但要滿足一些基本條件：有一定的pH調(diào)節(jié)范圍和足夠的緩沖容量；盡可能選擇濃度高而產(chǎn)生電流小的緩沖溶液；緩沖溶液的表觀淌度接近樣品組分的表觀淌度；對如多元醇、糖等，可選擇有絡(luò)合能力的緩沖溶液，如硼酸鹽緩沖溶液。

電滲是可控制組分的遷移方向和速度，進而影響分離效率和重現(xiàn)性，因此電滲的控制是電泳研究的關(guān)鍵。

v=μeoE=(ε0εζ4πη)E

式中，v為遷移率，μeo為電滲流， E 為電場強，ε0為真空介電常數(shù)，ε為緩沖液介電常數(shù) ，ζ為 Zeta 電勢，η為粘度。

如上公式所示，一般所有能改變ξ、ε和η的任何直接或間接的因素都可能用來控制電滲，直接因素如分離電場、粘度、介電常數(shù)和電動勢等；間接因素有：緩沖液的組成和pH、溫度、管壁性質(zhì)、外加電磁場等。其中溫度和緩沖液的組成通過影響粘度、介電常數(shù)和管壁的ξ等來影響電滲。外加電磁場則通過改變管壁表面的電荷數(shù)量及其分布來改變電滲。

離子強度(濃度)的變化，引起溶液粘度、擴散系數(shù)以及Zeta電勢的變化，從而影響分離效率和分離度。

實驗考察了氨鹽、磷酸鹽和硼酸鹽等堿性體系對測定的影響。發(fā)現(xiàn)硼酸鹽體系作緩沖溶液的分離效果最好，峰形和靈敏度較好。這可能是因為硼是缺電子原子，可以與化合物中帶孤對電子的氨配位形成絡(luò)合陰離子，增加樣品溶解度，減少了因吸附造成的拖尾等影響。

3.3 緩沖液pH的影響

考察硼酸鹽(Na2B4O7-NaOH)緩沖溶液的pH值(pH 9.2～11.5，用5 mmol/L NaOH調(diào)節(jié))對分離檢測的影響，結(jié)果如下。

運行緩沖液的pH值在CE中起著關(guān)鍵的作用，因為其會改變ζ-電位(ζ)，電滲流(EOF)以及分析物的總體電荷，并最終影響遷移時間和被分析物的分離。另外，改變緩沖溶液的pH，可改變某些組分的離子化狀態(tài)，改變其帶電性質(zhì)和數(shù)量，使淌度發(fā)生變化，而分析物離子狀態(tài)比中性狀態(tài)時在膠束中分配減少，從而影響選擇性。對于石英毛細管，在pH<2.5時，硅羥基基本不解離，電滲接近于零；而pH>10時，硅羥基解離基本完全，電滲變化很??；在pH=4～10之間，硅羥基的解離度隨pH上升而迅速增加，電滲亦迅速增強。實驗重點考察了pH值的影響，以獲得最佳的條件。

實驗對比了運行緩沖液為10 mM的硼酸鹽緩沖液(加入10 mM SDS)的pH值范圍從6至11.8對檢測的影響。結(jié)果顯示，pH值低于8.0，檢測不到明顯的峰，pH9.0、10.0、11.0可見標準物檢出，進一步細化對比pH9.2(此為未加入NaOH時pH值)、10.0、10.5、11.0、11.5幾個pH梯度。推測提高緩沖溶液的pH，使電滲流增加，縮短分析時間；另外，改變緩沖溶液的pH，可改變某些組分的離子化狀態(tài)，改變其帶電性質(zhì)和數(shù)量，使淌度發(fā)生變化，而分析物離子狀態(tài)比中性狀態(tài)時在膠束中分配減少，從而影響選擇性。兩種作用綜合的結(jié)果，在所檢測的堿性范圍內(nèi)隨pH增大，遷移時間有的延長有的變化不明顯。

由圖3可見，pH從9.2上升10.0時，除CIM外的分析物遷移時間變化顯著，原因可能在于其解離常數(shù)可能均在pH9.2以上，pH大于其解離常數(shù)后，其帶電荷數(shù)量變化明顯。同時CLB峰面積有明顯上升。pH從10.0上升到11.5時，各分析物峰面積未見明顯增強，除CLB外其它4種分析物遷移時間變動較小，推測其解離后取代的酚基去質(zhì)子化帶負電荷，使各分析物因為帶嵌入到膠束中的作用受抑制，整體電泳速度下降，與因為離子強度變化引起的電滲流增強作用相互抵消。pH10.5時分離度和峰形、峰高都較好，分離時間較短，因此，選擇pH為10.5的最適pH值，分析物能較好地分離。

整體上CLB遷移時間受pH影響比其它分析物更明顯。

圖3 不同pH緩沖液電泳譜圖的比較

3.4 緩沖液濃度的影響

考察硼酸鹽(Na2B4O7-NaOH)緩沖溶液濃度(5～30 mmol/L)對分離檢測的影響，結(jié)果見圖4。

圖 4 不同緩沖溶液的濃度下電泳譜圖比較

緩沖液中的離子主要起導(dǎo)電作用并影響分離效率，是電泳條件選擇的關(guān)鍵因素之一。離子一般通過影響雙電層的厚度來影響電滲，離子濃度上升，雙電層厚度減小，電滲下降。離子還可通過與管壁作用以及影響溶液的粘度、介電常數(shù)、離子活度等來影響電滲。離子強度(濃度)的變化，引起溶液粘度、擴散系數(shù)以及ζ電勢的變化，而且還會影響膠束的聚集數(shù)，從而影響分離效率和分離度。

實驗考察硼酸鹽(Na2B4O7-NaOH)緩沖溶液5種濃度(5、10、15、20、25mM)(pH 10.5，加入10mM SDS)對檢測的影響。

緩沖液的濃度低于10mM時CLB等分析物峰面積較小，且與RAC相距過近，不能得到很好的分離。當緩沖液的濃度升高時，峰面積無明顯變化，而遷移時間整體延長，較高的緩沖液的濃度也可能會引起的焦耳熱的增加，造成基線不穩(wěn)。因此，該體系中選擇了10 mM的硼酸鹽緩沖液(pH10.5)作為最佳的運行緩沖液。

3.5 表面活性劑(SDS)濃度的影響

緩沖溶液添加劑可用于改善分離效率和分離選擇性，緩沖溶液添加劑包括：表面活性劑、有機溶劑、中性鹽類、手性選擇劑。其中表面活性劑通過親水端或疏水端與樣品組分作用，影響組分的電泳性質(zhì)，從而改變體系的分離選擇性，與毛細管內(nèi)壁作用，減小內(nèi)壁的吸附作用，或改變電滲流的大小和方向。十二烷基硫酸鈉(SDS)是一種陰離子表面活性劑，在實驗中可具有如下作用：增大溶解度，形成膠束，可以使壁表面負電荷增加，Zeta電勢增大，電滲流增大。

由于這5種β-興奮劑在側(cè)鏈上都具有一個共同的β-羥胺基團，但芳基部分上的取代基彼此各不相同，如CLB和CIM苯胺取代基團，SAL，TER和RAC苯酚取代基團。5種β-興奮劑在膠束相和水相之間分配可能存在差異，故考慮采用MECC法分離，通過在緩沖介質(zhì)中加入SDS增大容量因子，并形成膠束，實現(xiàn)分離。

SDS在樣品的分離中起決定性作用，加入的濃度必須高過其臨界膠束濃度(在23℃～28℃時。SDS的臨界膠束濃度為7～10 mM)。實驗考察了10 mM的硼酸鹽緩沖液(pH10.5)分別加入0、5、10、15、20、25、30mM SDS對檢測的影響，結(jié)果顯示，在無SDS或SDS的濃度<5 mM的介質(zhì)中，樣品無法分離檢出；SDS的濃度在5 mM時，SAL和TER樣品峰相互重疊或相距過近；當SDS的濃度增大到10 mM時，5種樣品可以實現(xiàn)完全分離；繼續(xù)增大SDS的濃度，樣品的分離度增大，但遷移時間、背景噪音和焦耳熱也增加，峰會展寬，因此選擇在緩沖液中加入10 mM的SDS。圖5為不同SDS的濃度下電泳譜圖比較。

圖 5 不同SDS的濃度下電泳譜圖比較

3.6 分離電壓的影響

對分離電壓對分析物遷移時間的影響也進行了研究。對于一個給定的分離長度，分離電壓決定電場強度，從而會影響帶電分析物的遷移速度和電滲流的速度，這反過來又決定分析物的遷移時間。

實驗中，考察了16、20、24、28 kV(間隔4 kV)分離電壓的區(qū)別。高分離電壓下所有分析物的遷移時間縮短，同時，出現(xiàn)雜峰或分離不明顯，也加大了基線噪音并導(dǎo)致分離效率下降。分離電壓太低，峰信號也較低，且出峰時間較長，造成了較差的分辨率和更長的分析時間。

在實驗的基礎(chǔ)上，選擇20 kV電壓，出峰較快，且峰形較好。

3.7 毛細管柱溫度的影響

毛細管柱溫度是毛細管電泳中對分離有重要影響的參數(shù)。對于一個給定的分離長度、分離電壓，溫度主要影響溶液的粘度，從而影響電滲流的速度，進而影響分析物的遷移時間、分離度和分辨率。

實驗中，考察了10 mM的硼砂緩沖液(pH10.5加入10 mM SDS)15℃、20℃、25℃、30℃、35℃溫度條件對檢測的影響。如圖6所示，溫度對遷移時間有著非常顯著的影響，隨著溫度的升高，溶液粘度下降，電泳和電滲速度都增加，遷移時間明顯降低；但是溫度過高時，則更容易產(chǎn)生氣泡，樣品擴散加強也導(dǎo)致樣品峰信號減弱。另外，遷移時間過短易導(dǎo)致分辨率下降，為了保證實驗的重現(xiàn)性和可對比性，應(yīng)該嚴格保證實驗條件下的毛細管柱溫度。從分辨率優(yōu)先于分離時間的角度考慮，控制毛細管柱溫為25℃。

圖 6 不同毛細管柱溫度下電泳譜圖比較

3.8 有機溶劑對檢測的影響

甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等水溶性有機溶劑由于能影響和調(diào)節(jié)溶質(zhì)分子在膠束內(nèi)外兩相的分配而常被用作膠束毛細管電泳緩沖溶液添加劑。另外，由于樣品具有疏水基團，加入有機溶劑還可以增大樣品在緩沖溶液中的溶解度。實驗考察了4種溶劑(10%和20%兩個濃度下)對樣品溶液的影響，結(jié)果表明：甲醇、乙醇加入易使某些峰信號降低或者基線不穩(wěn)，乙腈和丙酮均可明顯改善峰形，20%濃度下還可以明顯縮短遷移時間。推測其原因是有機溶劑改善SDS對各樣品組分的包合作用。增強相對電遷移速率的同時，減少所檢測的藥物分子的負電荷密度，進而降低了本身反方向的電泳速度。

乙腈的加入可以增強電滲流。本實驗進一步驗證乙腈對檢測的影響發(fā)現(xiàn)：隨著乙腈體積分數(shù)的增加，樣品的遷移時間先增加(0～15%)，后降低(15%～20%),樣品的峰高在乙腈體積分數(shù)為15%后降低。這可能是因為隨著有機溶劑的增加，樣品的分配系數(shù)和體系的粘度降低，同時導(dǎo)致溶液的介電常數(shù)增加。這兩種相反的趨勢，使樣品的遷移時間出現(xiàn)先增加后降低的現(xiàn)象。樣品的峰高降低可能是因為乙腈改變了SDS的臨界膠束濃度，當乙腈的體積分數(shù)較小時，增強了膠束形成。當乙腈的體積分數(shù)增大到一定程度時，阻礙了膠束形成，使樣品的峰面積降低。但是添加有機溶劑也會使得遷移時間縮短后某些物質(zhì)峰相距過近，使直接稀釋樣品的藥物峰難于分辨，而對于有機溶劑萃取的樣品則不會存在這樣的問題，故可以視情況考慮有機溶劑的添加與否。圖7為添加兩種濃度的乙腈后電泳譜圖比較。圖8為添加兩種濃度的丙酮后電泳譜圖比較。

圖 7 添加兩種濃度的乙腈后電泳譜圖比較

圖 8 添加兩種濃度的丙酮后電泳譜圖比較

3.9 線性范圍、檢出限和精密度

配制了一系列不同濃度的沙丁胺醇、特布他林、萊克多巴胺和西馬特羅對照品溶液，在優(yōu)化的實驗條件下考察其線性范圍及檢出限，結(jié)果見表4。10 mg/L 的沙丁胺醇、特布他林、萊克多巴胺和西馬特羅重復(fù)20次進樣，峰面積和遷移時間相對標準偏差(RSD)分別低于9.3% 和8.1%。

3.10 樣品測定與加標回收實驗

在優(yōu)化的實驗條件下按照外標法進行定量，將尿液樣品稀釋5倍并在其中加入一定量的標準樣品進行加標回收實驗。結(jié)果見表5。

表4 線性范圍、回歸方程和檢出限

表5 樣品測定與加標回收實驗

注：回收測得含量為3次測量結(jié)果的平均值。

由圖9可見，一次進樣，在分離體系中同時得到5種樣品的檢測峰。加標樣品同標準品檢測峰的遷移時間基本相同。因此對于上述化合物，采用膠束毛細管電泳檢測系統(tǒng)，在分離譜圖上通過遷移時間的比較可以進行樣品峰的確證。若不一致，則為雜質(zhì)峰。

圖 9 標準品、實際樣品的膠束毛細管電泳分離檢測結(jié)果圖

4 結(jié)論

采用基于膠束電動毛細管色譜(MECC)和二極管陣列(DAD)檢測5種β-興奮劑，該方法簡單而可靠。在最佳條件下，5種β-興奮劑的檢測限為0.1～0.2 μg/ mL的(S/N>3)，14 min之內(nèi)可實現(xiàn)基線分離。通過分析尿樣加標樣品驗證了其適用性。

有文獻報道使用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測β-興奮劑，可以達到μg/L數(shù)量級以下，與之相比毛細管電泳方法作為一種藥物殘留檢測方法雖具有自己的優(yōu)點，但使用二極管陣列(DAD)檢測器，檢測限還有待提高。本實驗中DAD譜圖比較判斷5種藥物峰均為純物質(zhì)峰，故未在結(jié)果中詳細論述。使用激光誘導(dǎo)熒光(LIF)檢測器還可提高儀器靈敏度[22]，檢測限可達ng/mL，但是需要衍生化處理。另外，有機溶劑對于檢測結(jié)果的影響非常明顯，無論峰形和峰面積都可能隨著有機溶劑的加入而顯著變化，對于實際中各種形式的具體樣品，值得再深入、細致地研究。

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