朱立成，羅 輝，曾 鉑，殷帥文

慈菇中抗真菌蛋白分離純化初步研究

*朱立成1，羅 輝2，曾 鉑1，殷帥文1

（1.井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西，吉安 343009；2. 井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西，吉安 343009）

植物在長期進(jìn)化過程中，形成了一套天然的防御系統(tǒng)。其中植物抗真菌蛋白（antifungal protein，AFP）是主要成員之一，它對多種植物和人體病原真菌生長有抑制作用。本研究以慈菇（）塊莖為材料，運(yùn)用陽離子交換層析和葡聚糖G50凝膠過濾層析技術(shù)，結(jié)合活性追蹤法，對慈菇中的抗真菌蛋白進(jìn)行了初步分離純化。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定表明，純化的抗真菌蛋白并不是單一的組分，至少有3個(gè)電泳條帶，分子量集中在14.4~20.1 kD之間。純化的抗真菌蛋白對煙草赤星病菌（）的菌絲生長具有較明顯抑制作用。

慈菇； 抗真菌蛋白；抗真菌活性

0 前言

植物在生長發(fā)育過程中隨時(shí)會受到各種病原菌的侵染，所以在長期進(jìn)化過程中，其自身形成了一套天然的防御系統(tǒng)，產(chǎn)生一些物質(zhì)來與外源病菌對抗。植物抗真菌蛋白就是其中的一類，它們可抑制真菌生長或殺死真菌[1]。根據(jù)植物抗真菌蛋白血清學(xué)和蛋白質(zhì)序列分析結(jié)果，可將植物抗真菌蛋白大致分為七大類，包括病程相關(guān)蛋白、防御素、類親環(huán)素蛋白、核糖體失活蛋白、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蛋白酶抑制劑、2s清蛋白類等。植物抗真菌蛋白種類較多，其抗真菌機(jī)制也各有不同，如富含半胱氨酸的防御素(Defensins)能引起真菌細(xì)胞通透性的改變，導(dǎo)致真菌細(xì)胞的死亡；幾丁質(zhì)連接蛋白(chitin-binding proteins)通過干擾細(xì)胞壁的極化從而使得細(xì)胞生長受抑制[2]等。所以，尋找新的植物抗真菌蛋白，或者發(fā)現(xiàn)新的植物抗真菌蛋白的抗真菌機(jī)制，對于開發(fā)抗真菌的新藥具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

慈菇（）為澤瀉科多年生草本植物，以富含淀粉的球莖供食用。原產(chǎn)中國，歐洲作為觀賞植物栽培，中國、日本、印度和朝鮮作蔬菜用。中國主要產(chǎn)區(qū)分布于長江流域及其以南各省，太湖沿岸及珠江三角洲栽培尤多，北方栽培較少[3]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，慈菇性微寒，味甘苦，無毒。入心、肝、肺三經(jīng)，能清熱利尿，行血通淋，化痰止咳。目前關(guān)于慈菇抗真菌蛋白方面的研究報(bào)道較少，本文對慈菇塊莖中的抗真菌蛋白進(jìn)行初步的分離純化鑒定，并就其抗真菌活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

慈菇購于上海市楊浦區(qū)某菜市場。陽離子交換層析劑CM-Sephadex、葡聚糖G50購自 GE Healthcare；標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白購于上海西巴斯生物技術(shù)有限公司；其余生化試劑均為國產(chǎn)產(chǎn)品。

1.1.2 菌種

煙草赤星病菌（）菌種由井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 PDA培養(yǎng)基

稱取馬鈴薯200 g，切碎加蒸餾水煮后，取濾液加入20 g葡萄糖，20 g瓊脂定容至1000 mL，121℃滅菌20 min。待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，加入千分之一的100 mg/mL氨芐青霉素，混勻后倒平板備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗真菌蛋白抽提

準(zhǔn)確稱取100 g慈菇，加入100 mL pH 5.7的磷酸鹽緩沖液后磨碎，4℃抽提2 hr。抽提液經(jīng)4層紗布過濾后，12000 rpm離心20 min，取上清備用。

1.2.2 陽離子交換層析

用pH 5.7的磷酸鹽緩沖液平衡陽離子柱5-10個(gè)體積后，再將慈菇抽提上清液上柱。打開色譜工作站，280 nm檢測。上樣結(jié)束后分別用含0、0.1、0.3、0.5和1 mol/L NaCl的洗脫。收集洗脫峰濃縮后進(jìn)行抑菌活性的測定。

1.2.3 凝膠過濾層析

有抑菌活性峰凍干粉中加入2~3 mL pH 5.7 的磷酸鹽緩沖液，12000 rpm離心10 min ，上樣到預(yù)先用pH 5.7 的磷酸鹽緩沖液平衡的葡聚糖G-50層析柱中，pH 5.7 的磷酸鹽緩沖液洗脫后收集各洗脫峰，各峰濃縮后進(jìn)行抑菌活性的測定。

1.2.4 抑菌活性測定

采用瓊脂紙片擴(kuò)散法[4]。將煙草赤星病菌菌種分別接種于PDA固體培養(yǎng)基平板中央，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18~20 h，待菌落直徑達(dá)5 cm左右，在距離菌落邊沿約0.5 cm處貼上無菌φ6.25 mm濾紙片，并加10 μL樣品于濾紙片上，將平板置于28℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h左右后，觀察有無抑菌作用。

1.2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）[5]

有抑菌活性的凝膠過濾層析洗脫峰用SDS-PAGE電源鑒定，其分離膠濃度為15%，濃縮膠濃度為5%。恒壓電泳2 hr左右后，用考馬斯亮藍(lán)R250染色、脫色后比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽離子交換層析

利用陽離子交換柱對慈菇抽提液進(jìn)行純化，280 nm波長處檢測，用含不同濃度NaCl的pH5.7的磷酸鹽緩沖液洗脫，得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ等共5個(gè)洗脫峰，如圖1所示。將各峰收集濃縮后測活，發(fā)現(xiàn)有抑菌活性的成分主要集中在Ⅲ和Ⅳ洗脫峰。

圖1 慈菇抽提液陽離子交換層析色譜圖

2.2 葡聚糖G-50凝膠過濾層析

將陽離子交換層析有抑菌活性峰Ⅲ、Ⅳ經(jīng)凍干后溶解于pH5.7的磷酸鹽緩沖液中，經(jīng)過葡聚糖G-50層析柱凝膠過濾層析純化后，活性峰Ⅲ分離出3個(gè)不同的洗脫峰（如圖2所示），活性峰Ⅳ分離出4個(gè)不同的洗脫峰（如圖3所示）。

圖2 活性峰Ⅲ葡聚糖G50凝膠過濾層析圖

圖3 活性峰Ⅳ葡聚糖G-50凝膠過濾層析圖

2.3 各層析峰抑菌活性檢測

采用濾紙片擴(kuò)散法對陽離子交換層析各洗脫峰進(jìn)行測活，發(fā)現(xiàn)洗脫峰Ⅲ，Ⅳ具有較好的抗真菌活性，結(jié)果圖4所示。

從圖4可以看出，慈菇蛋白粗提液經(jīng)過陽離子交換層析后，具有抑菌活性的AFPs主要存于洗脫峰Ⅲ和洗脫峰Ⅳ中，洗脫峰Ⅰ中也有少量的抗真菌物質(zhì)，這些抗真菌物質(zhì)對煙草赤星病菌菌絲生長具有抑制活性。

1. 磷酸鹽緩沖液2. 洗脫液Ⅰ 3. 洗脫液Ⅲ 4. 洗脫液Ⅳ

1. Ⅲ①； 2. Ⅲ②；3. Ⅲ③； 4.磷酸鹽緩沖液

活性峰Ⅲ經(jīng)過G50凝膠過濾層析后，三個(gè)洗脫峰都有不同的抑菌效果，其中Ⅲ①活性峰抑菌效果稍差，而Ⅲ②、Ⅲ③活性峰抑菌效果較好?；钚苑澧艚?jīng)過G50凝膠過濾層析純化后，洗脫峰Ⅳ①、Ⅳ②、Ⅳ③抑菌效果較為明顯，而洗脫峰Ⅳ④無明顯抑菌效果。

2.4 SDS-PAGE電泳

將陽離子交換層析有抗菌活性峰Ⅲ和Ⅳ進(jìn)行葡聚糖G50凝膠過濾層析后，收集各洗脫峰中的蛋白溶液經(jīng)凍干濃縮至1~2 mL，取20 μL蛋白溶液加入5 μl 5×loading緩沖液混勻后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)果如圖7所示。從圖中可以看出，我們分離的抗真菌蛋白并不是單一的組分，至少有3個(gè)電泳條帶，分子量集中在14.4~20.1 kD之間。

1. Ⅳ①； 2. Ⅳ②；3. Ⅳ③； 4. Ⅳ④

1. Ⅳ③；2. Ⅳ②；3. Ⅳ①；4. Ⅲ③；5. Ⅲ②；6. Ⅲ①；M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量

3 討論

作物真菌病害是植物病害中最為嚴(yán)重的一類，嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)。尋找具有廣譜抗真菌活性的蛋白質(zhì)，克隆其基因，利用基因工程的方法導(dǎo)入植物中培育出抗病品種，或者轉(zhuǎn)入大腸桿菌或酵母里表達(dá)生產(chǎn)微生物農(nóng)藥是植物病害防治的重要方向之一，一些多肽抗生素已經(jīng)用于植物抗病基因工程。隨著對植物抗真菌蛋白作用機(jī)制的深入研究，越來越多的抗真菌蛋白基因?qū)⒈昏b定和克隆，通過一些更有效的改良基因工程策略的建立，植物抗真菌蛋白將在植物真菌病害的綜合防治中發(fā)揮更大的作用[2]。

植物抗菌蛋白通常為堿性蛋白。本研究利用陽離子交換層析和葡聚糖凝膠過濾層析等蛋白質(zhì)分離純化手段，結(jié)合活性追蹤法，從慈菇中初步分離純化出具有抑制煙草赤星病菌菌絲生長的抗真菌蛋白。雖然SDS-PAGE鑒定最終純化的抗真菌蛋白并不是單一蛋白組分，但是可以初步判斷慈菇中的抗真菌蛋白分子量大約為14.4kD左右。因?yàn)樵诖裙街泻胸S富的由179個(gè)氨基酸殘基組成的慈菇蛋白酶抑制劑，分子量約為20 kD左右[6]，圖7中20kD附近的蛋白質(zhì)條帶可能是慈菇蛋白酶抑制劑。但是，我們從預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，純化的天然慈菇蛋白酶抑制劑并沒有抑制煙草赤星病菌菌絲生長的活性（實(shí)驗(yàn)結(jié)果未在本文顯示）。所以慈菇中抗真菌蛋白應(yīng)該是圖7中14.4kD附近的兩個(gè)蛋白質(zhì)。關(guān)于慈菇塊莖中抗真菌蛋白的進(jìn)一步純化、其它理化性質(zhì)和作用機(jī)制有待于今后深入研究。

[1] 朱立成.中國紫藤種子抗真菌肽的研究[D].上海:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院,2010.

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PRELIMINARY STUDY ON ISOLATION AND PURIFICATION OF ANTIFUNGAL PROTEIN FROM

*ZHU Li-cheng1, LUO Hui2, ZENG Bo1, YIN Shuai-wen1

(1. School of Life Sciences, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China; 2. School of Medicine, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343000, China )

Plant antifungal proteins, the key component of innate immune system in plant, show a great potential in inhibiting or killing various human and plant pathogenic fungi. In this study, we tracked the bioactivity of antifungal proteins, used a series of methods such as cation exchange chromatography and sephadex G50 chromatography to isolate the antifungal proteins from. The results show that the purified antifungal proteins fromare not a single component, at least three protein bands those molecular weight range from 14.4~20.1 kD were detected by SDS-PAGE. The experiments of antifungal activity show that the purified antifungal proteins apparently inhibit the growth ofhypha

; antifungal protein (AFP); antifungal activity

Q939.11/S154.3

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2013.04.007

1674-8085(2013)04-0033-04

2013-04-01；

2013-06-26

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260076);江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2010GZN0125)

*朱立成(1972-），男，江西吉水人，副教授，博士，主要從事生物化學(xué)研究(E-mail：zjist@yahoo.com.cn)；

羅 輝(1971-），男，江西吉水人，副教授，碩士，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究(E-mail：jgsmcxb@163.com);

曾 鉑(1985-），男，江西泰和人，井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院本科生(E-mail：smkx05by@126.com);

殷帥文(1978-），男，湖南瀏陽人，副教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)(E-mail：shwyin@126.com).