劉家宏 ，徐小潔 ，符靜 ，范忠義 ，呂朝暉 ，陸菊明 ，肖文華 ，葉棋濃 ，朱建華

1.解放軍總醫(yī)院 a.第一附屬醫(yī)院腫瘤科，北京 100037；b.內(nèi)分泌科，北京 100853；

2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850

隨著老齡化社會(huì)的加速及生存環(huán)境、生活方式的改變，惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率逐漸升高，成為威脅人類生命健康的重要因素。腫瘤抑制因子p53是迄今發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系最為密切的抑癌基因[1]。研究表明[2]，50%以上的惡性腫瘤病人發(fā)生了p53基因突變。由于點(diǎn)突變、基因片段缺失和p53蛋白失活等導(dǎo)致的p53功能缺陷，可通過(guò)多種分子機(jī)制引起細(xì)胞過(guò)度增殖和遺傳物質(zhì)的改變，逃避機(jī)體對(duì)癌變細(xì)胞的免疫監(jiān)控作用,最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[3]。p53與機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能和免疫反應(yīng)關(guān)系密切，表現(xiàn)在：一方面，p53，尤其是突變型p53可以作為腫瘤相關(guān)抗原激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)；另一方面，p53可以直接啟動(dòng)免疫細(xì)胞中一些基因的表達(dá)，從而對(duì)這些細(xì)胞的增殖和功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，以達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的[4]。因此，尋求增加內(nèi)源性p53蛋白的表達(dá)，可以成為治療腫瘤的一個(gè)突破點(diǎn)。

基因表達(dá)可以在不同水平上進(jìn)行調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是調(diào)控表達(dá)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。轉(zhuǎn)錄因子是廣泛存在于機(jī)體各種組織、細(xì)胞中能夠結(jié)合靶序列的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)能夠調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中起重要作用。為了研究p53在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，篩選出新的調(diào)控p53的轉(zhuǎn)錄因子，我們從人HepG2細(xì)胞基因組中擴(kuò)增出p53基因約3 kb的啟動(dòng)子，將其克隆至螢光素酶報(bào)告基因載體pGL4.0-empty中，為研究p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和尋找治療腫瘤的新靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

SV40病毒轉(zhuǎn)化的人胚胎腎293T細(xì)胞、乳腺癌ZR75-1細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞由本室傳代培養(yǎng)；pGL4.0-empty載體及螢光素酶底物購(gòu)自Promega公司；限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、Prim?erStar酶購(gòu)自TaKaRa公司；DNA純化試劑盒購(gòu)自申能博彩公司；DMEM培養(yǎng)基及小牛血清均購(gòu)自Gibco公司；Vigofect轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Vigorous公司。引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，測(cè)序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2 人p53啟動(dòng)子片段的擴(kuò)增

以人肝癌細(xì)胞HepG2的基因組為模板，在NCBI網(wǎng)站搜索并合成p53啟動(dòng)子序列。上游引物為5'-GGGGTACCAGCCTTCACATGACTGATCCCTTAT CCTC-3'，下游引物為5'-CCGCTCGAGGAAAACCC CAATCCCATCAACCCCT-3'。上下游引物5'端分別攜帶KpnⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；94℃ 1 min，62℃ 30 s，72℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測(cè)序

在37℃下，用KpnⅠ/XhoⅠ雙酶切pGL4.0-empty載體4 h，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR產(chǎn)物回收后再用KpnⅠ/XhoⅠ雙酶切，用T4DNA連接酶連接入pGL4.0-empty載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，振蕩培養(yǎng)并提質(zhì)粒，KpnⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，將酶切鑒定正確的克隆送北京奧科生物公司測(cè)序。

1.4 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

按常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染[5]，用不含雙抗、含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將人胚腎293T細(xì)胞接種于24孔板中，接種量以轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到80%為宜，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將總量為1.0 μg的質(zhì)粒與25 μL 生理鹽水混合，再將 0.5 μL Vigofect與 25 μL生理鹽水混合，然后將上述2種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入24孔板中，37℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)。

1.5 螢光素酶和β-半乳糖苷酶活性測(cè)定

螢光素酶活性測(cè)定基本按Promega公司的試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，吸掉培養(yǎng)基，用PBS洗1次，加入100 μL裂解緩沖液，室溫輕搖15 min，刮下細(xì)胞，收集到1.5 mL的離心管中，振蕩5 min，4℃、12 000 r/min離心3 min，收集上清液，用熒光劑測(cè)量熒光值。

用ONPG測(cè)定β-半乳糖苷酶活性。將30 μL上述上清液與100 μL預(yù)先以9∶2混勻的Z緩沖液/β-巰基乙醇∶ONPG溶液混合，37℃溫育，直到出現(xiàn)淺黃色為止；加入250 μL濃度為1 mol/L的Na2CO3終止顏色反應(yīng),測(cè)定樣品的D420nm值。取熒光值平均值與對(duì)應(yīng)的β-半乳糖苷酶活性值相除，將未加重組質(zhì)粒的數(shù)值歸一，與此相比所得倍數(shù)為最終結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 人p53啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增

以人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞的基因組為模板，PCR擴(kuò)增p53的啟動(dòng)子序列，PCR產(chǎn)物約3000 bp，與預(yù)期片段大小一致（圖1）。

2.2 p53啟動(dòng)子報(bào)告基因的構(gòu)建與鑒定

用KpnⅠ/XhoⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物后，克隆到經(jīng)同樣雙酶切的pGL4.0-empty載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選的陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，得到與預(yù)期長(zhǎng)度一致的插入片段,而空載體酶切只見一條載體帶（圖2），表明p53啟動(dòng)子已插入pGL4.0-empty上游的多克隆位點(diǎn)中。測(cè)序結(jié)果證實(shí)與已知序列一致（數(shù)據(jù)略）。

2.3 293T細(xì)胞中p53啟動(dòng)子活性的測(cè)定

圖1 目的基因的PCR擴(kuò)增

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

在293T細(xì)胞中，分別轉(zhuǎn)染pGL4.0-empty和不同濃度梯度的pGL4.0-pp53，螢光素酶活性測(cè)定結(jié)果見圖3。與空載體相比，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后螢光素酶活性明顯提高，且螢光素酶活性隨轉(zhuǎn)染劑量的升高逐漸增高，說(shuō)明pGL4.0-pp53在293T細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性，且轉(zhuǎn)錄活性呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)。

2.4 ZR75-1、HepG2、A549細(xì)胞中p53啟動(dòng)子活性的測(cè)定

為了驗(yàn)證p53啟動(dòng)子的活性是細(xì)胞特異性還是在多種細(xì)胞中有廣泛效應(yīng)，將pGL4.0-pp53重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人乳腺癌ZR75-1細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞及肺癌A549細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞測(cè)定螢光素酶活性。結(jié)果見圖4，與空載體相比，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后ZR75-1、HepG2、A549細(xì)胞中的螢光素酶活性提高了幾倍至數(shù)十倍，表現(xiàn)了重組質(zhì)粒中的p53啟動(dòng)子活性，說(shuō)明p53啟動(dòng)子在多種細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性。

2.5 轉(zhuǎn)錄因子USF對(duì)p53報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的影響

轉(zhuǎn)錄因子USF是一種已知的能升高p53轉(zhuǎn)錄水平的轉(zhuǎn)錄因子[6]，我們通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子USF對(duì)p53啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響，驗(yàn)證了pGL4.0-pp53的活性及功能，結(jié)果見圖5。在293T細(xì)胞中，將不同劑量的USF和pGL4.0-pp53共轉(zhuǎn)，螢光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著轉(zhuǎn)錄因子USF劑量的增加，p53啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性也逐步增加，說(shuō)明USF對(duì)p53的活性調(diào)節(jié)呈劑量依賴效應(yīng)，也進(jìn)一步表明我們所構(gòu)建的pGL4.0-pp53具有與文獻(xiàn)報(bào)道一致的活性及功能。

3 討論

惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類生命的重要疾病之一，目前全球約有1000萬(wàn)人患有惡性腫瘤，每年有800余萬(wàn)人死于惡性腫瘤，而且這一數(shù)字呈不斷增長(zhǎng)的趨勢(shì)。由于p53能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并能參與機(jī)體細(xì)胞、體液免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)凋亡，因此p53表達(dá)的精細(xì)調(diào)節(jié)顯得尤為重要?；虮磉_(dá)是遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，可以在不同水平上進(jìn)行調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是調(diào)控表達(dá)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控主要依靠轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄因子之所以能誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，主要是與目的基因的啟動(dòng)子相互作用。Damell等[7]也認(rèn)為，選擇轉(zhuǎn)錄因子作為抗腫瘤靶點(diǎn)是合理的。野生型p53蛋白的活性形式為四聚體，自N端起依次為轉(zhuǎn)錄活化區(qū)、DNA結(jié)合區(qū)、四聚體化區(qū)和C端調(diào)節(jié)區(qū)，其啟動(dòng)子區(qū)域不含TATA盒，也沒有富含GC區(qū)域，而后兩者均為促進(jìn)轉(zhuǎn)錄開始的重要應(yīng)答元件。雖然它在互補(bǔ)鏈-80位上含有CAAT盒，但是否有轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合目前還不甚清楚。p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,其中包括許多已證實(shí)和未證實(shí)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。對(duì)p53轉(zhuǎn)錄因子的篩選，可能有助于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤治療的靶標(biāo)。因此，我們構(gòu)建的p53啟動(dòng)子調(diào)控的螢光素酶報(bào)告基因?qū)⒃趐53轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的研究及篩選新的調(diào)控p53的轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)揮重要作用。

轉(zhuǎn)錄因子USF是一種細(xì)胞編碼的轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)某些病毒及基因的轉(zhuǎn)錄。該因子以位點(diǎn)特異性方式結(jié)合CACGTG[8]，在腺病毒中使腺病毒后期啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性增加3～25倍。USF通過(guò)靠近蛋白N端的2個(gè)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域激活靶基因轉(zhuǎn)錄活性，而起始蛋白TFⅡ-Ⅰ也參與這一過(guò)程?；钚詼y(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄因子USF能明顯增高p53的活性，與文獻(xiàn)報(bào)道相符，證明我們所構(gòu)建的p53啟動(dòng)子的螢光素酶報(bào)告基因是可靠并具有活性的。

另外，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的p53啟動(dòng)子調(diào)控的螢光素酶報(bào)告基因序列已知，且是天然存在的。螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)靈敏，可以一次篩選多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，這為發(fā)現(xiàn)新的p53轉(zhuǎn)錄因子奠定了扎實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖3 不同劑量p53啟動(dòng)子活性的測(cè)定

圖4 不同細(xì)胞中p53啟動(dòng)子活性的測(cè)定

圖5 不同劑量USF對(duì)p53啟動(dòng)子報(bào)告基因的影響

[1]Levine A J,Momand J,Finlay C A.The p53 tumour suppres?sor gene[J].Nature,1991,351(6326):453-456.

[2]Royds J A,Iacopetta B.p53 and disease:when the guardian angel fails[J].Cell Death Differ,2006,13(6):1017-1026.

[3]Bargonetti J,Manfredi J J.Multiple roles of the tumor sup?pressor p53[J].Curr Opin Oncol,2002,14(1):86-91.

[4]賈曉.p53與抗腫瘤免疫[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2008,12:1214-1215.

[5]Datta R,Rubin E,Sukhatme V,et al.Ionizing radiation acti?vates transcription of the EGR1 gene via CArG elements[J].Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(21):10149-10153.

[6]Pognonec P,Roeder R G.Recombinant 43-kDa USF binds to DNA and activates transcription in a manner indistinguish?able from that of natural 43/44-kDa USF[J].Mol Cell Biol,1991,11(10):5125-5136.

[7]Damell J E Jr.Transcription factors as targets for cancer ther?apy[J].Nat Rev Cancer,2002,2(10):740-749.

[8]Reisman D,Rotter V.The helix-loop-helix containing tran?scription factor USF binds to and transactivates the promoter ofthe p53 tumorsuppressorgene[J].Nucleic AcidsRes,1993,21(2):345-350.